基于甜味受体信号通路探讨玉竹多糖的降血糖作用

杨华生，龚芬芳，柳 婷，李 婷，吴 璐

（江西中医药大学，江西 南昌 330004）

玉竹为百合科植物玉竹Polygonatumodoratum（Mill.）Druce 的干燥根茎，主要含有玉竹多糖、黄酮、皂苷等成分，其中玉竹多糖降血糖作用确切，是玉竹研究聚焦的成分，也是评价玉竹质量的主要指标［1］。近年来研究发现，甜味受体与降血糖作用关系密切［2］。

甜味受体属于味觉受体第一家族成员（taste receptor family 1member，T1R）［3］。T1R 由T1R1、T1R2、T1R3 构成，T1R2 和T1R3 以二聚体的形式构成甜味受体。甜味受体不仅存在于味蕾感知甜味，还存在于肠道介导胃肠激素释放［4］。甜味剂与T1R2／T1R3 结合后，α-gustducin 活化，cAMP上升，Ca2＋内流，胰高血糖素样肽-1 （glucagonlikepeptide1，GLP-1）分泌［5］。也有研究表明，甜味剂还可通过瞬时受体电位M 亚型5 （TRPM5）途径促进GLP-1 分泌［6］。GLP-1 不仅能促进胰岛素的分泌［7］，还能影响葡萄糖的肠道吸收。一般认为，葡萄糖通过刷状缘膜的钠／葡萄糖协同转运蛋白1 （sodium-glucose cotransporter 1，SGLT-1）吸收进入细胞，然后通过基底膜的葡萄糖转运蛋白2 （glucose transporter 2，GLUT-2）进入血液。研究发现，GLP-1 的释放是由刷状缘膜上SGLT-1 介导的［8］。因此，本研究采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱导糖尿病模型，研究玉竹多糖对糖尿病大鼠空腹血糖、血脂、胰脏和肝脏组织形态、糖耐量、GLP-1、胰岛素及甜味受体信号通路中信号蛋白T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5、SGLT-1、GLUT-2 mRNA 表达的影响，并进一步采用细胞模型验证，从甜味受体的角度阐明玉竹多糖降血糖机理，为玉竹的应用及评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器 罗氏LightCycler® 96 实时荧光定量PCR 仪、罗氏活力型血糖仪（瑞士Roche 公司）；核酸蛋白测定仪（美国赛默飞公司）； 激光共聚焦显微镜、倒置显微镜（德国徕卡公司）； 生化培养箱（上海博泰实验设备有限公司）； 多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）； GEL DOC XR＋凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）； DYY-7C 型电泳仪（北京六一仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂 玉竹饮片购自安徽道源堂中药饮片有限公司，经江西中医药大学付小梅教授鉴定为百合科植物玉竹Polygonatumodoratum（Mill.）Druce 的干燥根茎。M5 Realtime PCR Super mix（批号21DB2535，北京聚合美生物科技有限公司）； GLP-1 试剂盒（批号R0996G011S，武汉菲恩生物科技有限公司）； 胰岛素试剂盒 （批号A322001245，杭州联科生物技术股份有限公司）；胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、cAMP 试剂盒 （ 批号 20210106、20210107、20210107、20210106、20210611，南京建成生物工程研究所有限公司）； 苏木素染色液、伊红染色液、链脲佐菌素（STZ）、柠檬酸钠缓冲液（批号20210226、20210204、616S0210、A20201109，北京索莱宝科技有限公司）； 盐酸二甲双胍（批号ABS0267，中美上海施贵宝制药有限公司）； RNA提取试剂盒（批号20210424，北京聚合美生物科技有限公司）； 透析膜 （ 3 000 Da，批号SP132680，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 实验动物及细胞株 SPF 级SD 雄性大鼠，体质量（180±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （湘）2019-0004］，饲养于江西中医药大学动物房，环境室温20～25 ℃，相对湿度40% ～60%，12 h 光照和12 h 黑暗交替，自由进食饮水，实验操作均符合实验动物使用指导原则，实验方案取得江西中医药大学伦理委员会审核批准 （伦理号JZSYDWLL-20201215）。人十二指肠腺癌细胞HuTu-80 细胞株，购自上海富衡生物科技有限公司。

2 方法

2.1 玉竹多糖的制备及表征 取玉竹饮片，粉碎，加水回流提取2 次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩至生药量0.25 g／mL。取提取液，加适量Sewage 试剂，振荡摇匀，收集上清液，重复操作5次； 合并上清液，加入乙醇，冷藏，收集沉淀，干燥，得玉竹粗多糖。取玉竹粗多糖适量，超纯水溶解，使用3 500 Da 透析膜去除小分子物质，浓缩干燥即得玉竹纯化多糖。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，采用考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质的含量，采用HPLC-ELSD 法测定低分子糖的含量，采用PMP 柱前衍生-HPLC 法分析玉竹多糖中单糖的组成，采用红外光谱法分析玉竹多糖中的官能团结构，对玉竹多糖进行表征。

2.2 动物实验

2.2.1 模型制备、分组及给药 将大鼠随机分为正常组（8 只）和造模组（40 只），正常组大鼠给予普通饲料喂养，造模组大鼠给予高脂高糖饲料（66.5%基础饲料＋10%猪油＋20%蔗糖＋2.5%胆固醇＋1% 胆酸钠）喂养，饲养4 周后，禁食12 h，腹腔注射2% STZ ［30 mg／kg，溶于0.1 mmol／L 柠檬酸缓冲液（pH 4.5）］，1 周后再次禁食12 h，腹腔注射2% STZ，72 h 后测定大鼠空腹血糖，空腹血糖值≥11.1 mmol／L，表明造模成功［9］。将造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组（200 mg／kg）和玉竹多糖低、中、高剂量组 （100、200、400 mg／kg，按临床剂量及纯化多糖得率换算），每天灌胃给药1 次，持续8 周。

2.2.2 空腹血糖测定 给药前及给药后的第2、4、6、8 周末，禁食12 h 后尾静脉取血，采用血糖仪测定大鼠的空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG）。

2.2.3 口服葡萄糖耐量实验及血清GLP-1、胰岛素检测 给药第7 周末，各组大鼠禁食过夜，然后以2 g／kg 葡萄糖溶液灌胃，分别在灌胃后0、0.5、1、1.5、2 h 这5 个时间点，尾静脉取血，采用血糖仪测定血糖值，绘制“时间-血糖” 曲线，并计算其血糖曲线下面积（AUC）［10］。同时，在相同的时间点，分别从眼睑内采集血样，离心，收集血清，严格按照相应试剂盒说明书检测各组大鼠血清GLP-1、胰岛素水平。

2.2.4 血脂水平检测 给药结束后，各组大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血，室温静置4 h，4 ℃、3 000 r／min 离心10 min，分离血清，按试剂盒说明书检测大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平。

2.2.5 胰脏、肝脏组织形态学观察 给药结束后，麻醉大鼠，取胰脏、肝脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h，流水冲洗20 min，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，于光学显微镜下观察胰脏、肝脏组织形态。

2.2.6 RT-qPCR 法检测回肠组织甜味信号表达给药结束后，麻醉大鼠，取回肠于-80 ℃超低温冰箱保存。实验时，取回肠组织约30 mg 于匀浆器中，按RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA 后进行PCR 反应。以β-actin为内参，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。扩增反应条件为95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共50 个循环，最后另外获取熔解曲线。每个样品设3 个平行孔，反应结束后，得到各孔循环阈值（CT值），采用2-ΔΔCT法计算各目的基因mRNA 相对表达量。

表1 引物序列ⅠTab.1 Primer sequences Ⅰ

2.3 细胞实验

2.3.1 细胞内cAMP 水平及细胞分泌GLP-1 水平检测 取对数生长期的HuTu-80 细胞，按每孔4×105个的密度接种于6 孔板中，细胞贴壁后吸去培养基，分别加入低、高剂量玉竹多糖溶液（0.1、0.4 mg／mL），正常组加入等体积细胞培养液，孵育48 h 后吸去培养基，加入无糖培养基孵育3 h，再加入0.2 mg／mL 葡萄糖溶液孵育15 min，弃培养基，加裂解液，收集细胞，离心后取上清，按试剂盒说明书检测细胞内cAMP 水平。另取对数生长期的HuTu-80 细胞，分组及操作同上，加入0.2 mg／mL 葡萄糖溶液孵育1 h 后，吸取细胞培养液于EP 管内，离心后取上清液，按试剂盒说明书检测细胞外GLP-1 水平。

2.3.2 激光共聚焦法检测钙离子荧光强度 取对数生长期的HuTu-80 细胞，以1×106／mL 的密度接种于激光共聚焦培养皿底孔中，静置，贴壁。按“2.3.1” 项下方法分组及给药处理，加入无糖培养基孵育3 h，避光加入150 μL 2 μmol／L Fluo-3／AM，37 ℃孵育10 min，PBS 清洗 2 次，再加入0.2 mg／mL葡萄糖溶液孵育5 min，吸去培养液，PBS 清洗2 次，加入PBS 缓冲液后放入培养箱中继续培养15 min，于激光共聚焦显微镜下观察并拍照，采用Image Pro Plus 软件对图片进行分析，测定每张图片的荧光强度总和，以单位面积荧光强度为指标，分析Ga2＋水平［11］。

2.3.3 RT-qPCR 法检测HuTu-80 细胞甜味受体表达 取对数生长期的HuTu-80 细胞，以1×106／mL的密度接种于6 孔板中，按“2.3.1” 项下方法分组及给药处理，孵育48 h 后，利用RNA 提取试剂盒提取HuTu-80 细胞总RNA，逆转录后进行PCR反应，操作步骤同“2.2.6” 项。以GAPDH为内参，引物序列见表2。

表2 引物序列ⅡTab.2 Primer sequences Ⅱ

2.4 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 玉竹多糖的表征 玉竹经过水提、祛蛋白、醇沉、去小分子物质后，得到玉竹纯化多糖，其纯度为88.29%，杂质蛋白质含量为0.19%，且不含有葡萄糖、木糖、鼠李糖、果糖、蔗糖等低分子糖，见图1A ～1B。单糖组成测定结果见图1C ～1D，结果显示，玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5 种单糖组成，其摩尔比为21.08 ∶2.31 ∶14.13 ∶3.32 ∶0.41。红外分析图见图1E，研究表明，3 364.21 cm-1为羟基的伸缩振动峰，2 934.19 cm-1的强肩峰是糖环中的C-H伸缩振动峰，这2 个是典型的多糖特征峰［12］；1 629 cm-1、1 421.95 cm-1表明多糖中含有糖醛酸［13］； 1 024.14 cm-1处的吸收峰表明了吡喃环的存在［14］； 930.88 cm-1处出现的强吸收峰，表明玉竹多糖主要由β 型糖苷键组成［15］； 816.18 cm-1处的尖峰表明可能存在α 型糖苷键［16］。以上结果表明，玉竹多糖是一种含有羧基、β 型糖苷键、吡喃环，可能含有α 型糖苷键的多糖。

图1 玉竹多糖的纯度、单糖组成、官能团分析Fig.1 Purity，monosaccharide composition and functional group analysis of P.odoratum polysaccharides

3.2 玉竹多糖对糖尿病大鼠空腹血糖的影响 如图2 所示，与正常组比较，模型组大鼠FBG 水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，给药第2 周起，玉竹多糖中、高剂量组和二甲双胍组大鼠FBG 水平降低（P＜0.05）。

图2 给药期间大鼠FBG 水平变化（x±s，n＝8）Fig.2 Changes of rat FBG level during drug administration （x±s，n＝8）

3.3 玉竹多糖对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响 如图3A 所示，正常组大鼠基础血糖低，口服葡萄糖后，血糖升高，但0.5 h 后逐渐下降； 模型组大鼠基础血糖高，口服葡萄糖后，血糖持续升高，1.5 h 后才开始逐渐下降，而玉竹多糖高剂量组大鼠1.0 h 后开始下降。进一步计算各组AUC值，如图3B 所示，与正常组比较，模型组大鼠AUC 增加（P＜0.05）； 与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组和二甲双胍组大鼠AUC 降低（P＜0.05）。

图3 玉竹多糖对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响（x±s，n＝8）Fig.3 Effects of P.odoratum polysaccharides on OGTT of diabetic rat （x±s，n＝8）

3.4 玉竹多糖对糖尿病大鼠血清GLP-1、胰岛素分泌的影响 如图4A 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清GLP-1 水平在各个时间点均降低（P＜0.05）； 与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组和二甲双胍组大鼠血清GLP-1 水平在各个时间点均升高（P＜0.05）。如图4B 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清胰岛素水平在0、0.5、1、1.5 h时均降低（P＜0.05），在2 h 时升高（P＜0.05）；与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组和二甲双胍组大鼠血清胰岛素水平在各时间点均升高（P＜0.05），且在1 h 时出现胰岛素分泌高峰。

图4 玉竹多糖对糖尿病大鼠血清GLP-1 及胰岛素分泌的影响（x±s，n＝8）Fig.4 Effects of P.odoratum polysaccharides on serum levels of GLP-1 and insulin in diabetic rat （x±s，n＝8）

3.5 玉竹多糖对糖尿病大鼠血脂水平的影响 如表3 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平升高（P＜0.05），HDL-C 水平降低（P＜0.05）； 与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组和二甲双胍组大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平降低（P＜0.05），玉竹多糖高剂量组大鼠血清HDL-C 水平升高（P＜0.05）。

表3 玉竹多糖对糖尿病大鼠血脂水平的影响（mmol／L，x±s，n＝8）Tab.3 Effects of P.odoratum polysaccharides on blood lipid level of diabetic rat models （mmol／L，±s，n＝8）

表3 玉竹多糖对糖尿病大鼠血脂水平的影响（mmol／L，x±s，n＝8）Tab.3 Effects of P.odoratum polysaccharides on blood lipid level of diabetic rat models （mmol／L，±s，n＝8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05； 与模型组比较，▲P＜0.05。

组别TCTGLDL-CHDL-C正常组1.18±0.230.63±0.070.39±0.091.32±0.19模型组2.73±0.18＃2.15±0.22＃1.22±0.06＃0.80±0.24＃二甲双胍组1.60±0.19▲1.04±0.24▲0.68±0.06▲1.20±0.26▲玉竹多糖低剂量组2.72±0.312.01±0.251.17±0.110.88±0.21玉竹多糖中剂量组1.91±0.17▲1.44±0.26▲0.80±0.06▲0.96±0.19玉竹多糖高剂量组1.76±0.22▲1.18±0.21▲0.73±0.07▲1.10±0.18▲

3.6 玉竹多糖对糖尿病大鼠胰脏、肝脏组织形态的影响 如图5 所示，正常组大鼠胰岛组织结构清晰，细胞分布均匀； 而模型组大鼠胰岛组织萎缩变形，边界模糊不清，细胞空泡变性； 与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组大鼠胰岛组织损伤得到改善，胰岛面积增大，结构趋向完整，边界清晰，细胞数目增多。同时，正常组大鼠肝组织结构和形态正常，且没有炎症细胞浸润； 模型组大鼠肝索紊乱，肝细胞质有一定程度的空泡结构，组织结构紊乱、排列不规则，细胞内液态积聚增多； 与模型组比较，玉竹多糖中、高剂量组大鼠肝细胞损伤得到改善，肝脏细胞内液态积聚减少，受损细胞数量减少，细胞形态、个体间排列情况均有所改善。

图5 玉竹多糖对糖尿病大鼠胰脏、肝脏组织形态的影响（×100）Fig.5 Effects of P.odoratum polysaccharides on the morphology of pancreas and liver in diabetic rat （×100）

3.7 玉竹多糖对糖尿病大鼠甜味受体通路相关蛋白mRNA 表达的影响 如图6 所示，与正常组比较，模型组大鼠回肠组织T1R2、T1R3、αgustducin、TRPM5 mRNA 表达降低（P＜0.05），而SGLT-1、GLUT-2 mRNA 表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，玉竹多糖高剂量组T1R2、T1R3、αgustducin、TRPM5 mRNA 表达升高（P＜0.05），中剂量组T1R3、TRPM5 mRNA 表达升高 （P＜0.05），各剂量组SGLT-1、GLUT-2 mRNA 表达无明显变化（P＞0.05）。

图6 玉竹多糖对糖尿病大鼠甜味受体通路相关蛋白mRNA 表达的影响（x±s，n＝8）Fig.6 Effects of P.odoratum polysaccharides on mRNA expressions of sweet receptors in diabetic rat （x±s，n＝8）

3.8 玉竹多糖对HuTu-80 细胞cAMP、Ca2＋、GLP-1 水平和T1R2、T1R3 mRNA 表达的影响 如图7A 所示，与正常组比较，玉竹多糖各剂量组细胞内cAMP、GLP-1 水平均升高（P＜0.05）。如图7B 所示，与正常组比较，玉竹多糖各剂量组细胞T1R2、T1R3 mRNA 表达升高（P＜0.05）。如图7C所示，与正常组（0.007±0.002）比较，玉竹多糖低、高剂量组细胞内Ca2＋荧光强度 （0.019 ±0.002、0.044±0.008）增强（P＜0.05）。

图7 玉竹多糖对HuTu-80 细胞cAMP、Ca2＋、GLP-1 水平和T1R2、T1R3 mRNA 表达的影响（±s，n＝6）Fig.7 Effects of P.odoratum polysaccharides on cAMP，Ca2＋，GLP-1 levels and T1R2，T1R3 mRNA expressions in HuTu-80 cells （±s，n＝6）

4 讨论

糖尿病是一组由多种病因引起的，胰岛素分泌缺陷和（或）作用受损，以慢性高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。西医学上的“糖尿病” 与中医学的“消渴” 有一定关联，消渴的基本病机为“阴虚燥热”。玉竹味甘，甘能补阴。甘味，又可称为“甜味”，激动舌头味蕾上的甜味受体即可感觉到“甜味”，激动胃肠道的甜味受体则可促进GLP-1 的分泌，降低血糖，改善 “阴虚” 证／症状。因此，“甜味受体” 在一定程度上可把糖尿病、阴虚联系起来。研究表明，糖尿病发生过程中，甜味受体及其信号分子α-gustducin、TRPM5表达下调，GLP-1 分泌减少［17］。基于本研究动物实验、细胞实验的结果，结合文献［18-20］报道，推测玉竹多糖主要通过促进T1R2、T1R3、αgustducin、TRPM5 mRNA 表达，增强甜味受体信号通路的强度，在体内葡萄糖的参与下，促进GLP-1的分泌，从而发挥降血糖作用。因此，可从“甜味受体” 的角度，同时阐释玉竹治疗阴虚证、糖尿病的作用机制，即多糖降血糖作用与甜味受体T1R2、T1R3 及信号分子α-gustducin、TRPM5 的表达密切相关。

SGLT-1、GLUT-2 是肠道吸收葡萄糖的转运体，SGLT-1 与Na＋、葡萄糖结合成复合物，以主动转运的方式将葡萄糖转入细胞内，而GLUT-2 则通过被动转运的方式将葡萄糖转入细胞内，二者维持机体葡萄糖代谢平衡［21］。研究发现，糖尿病会导致SGLT-1 和GLUT-2 在肠道中的表达量异常增加［22］。本研究发现，玉竹多糖对糖尿病大鼠回肠组织SGLT-1、GLUT-2 mRNA 表达无明显影响，提示玉竹多糖降血糖作用与SGLT-1、GLUT-2 无明显关联。

中药多糖是一种由糖苷键构成的高分子物质。研究表明，多糖具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、护肝、降血糖等药理活性［23］。多糖在临床上可制备成注射剂，也可开发成口服制剂，且含多糖的中药，主要给药方式为口服。有报道称，多糖是通过水解为寡糖起作用［24］，但目前多认为，多糖起效的部位是在“肠道”，如多糖可通过肠道菌群［25］、紧密连接蛋白［26］等发挥药理作用。进一步研究表明，多糖在肠道中可以通过激活多种核受体调控相关蛋白的表达［27］。因此，本研究从肠道甜味受体的角度阐明玉竹多糖的降血糖机制，也在一定程度上证实多糖的作用部位是在“肠道”，但玉竹多糖是通过何种机制影响肠道中甜味受体信号蛋白的表达，还有待深入研究。