结节病样肉芽肿动物模型的研究进展*

韩悦殷，刘梦远，代华平△，王 辰

（1中国医学科学院，北京协和医学院，北京 100730；2中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科，国家呼吸医学中心，国家呼吸临床研究中心，中国医学科学院呼吸病学研究院，北京 100029）

结节病（sarcoidosis）是以非干酪样坏死性上皮样肉芽肿为病理特征的系统性肉芽肿性疾病，以肺和胸内淋巴结受累最为常见。肉芽肿病变分为中心区和周边区两部分，中心区由淋巴细胞包绕上皮样细胞或多核巨细胞而成；周边区由淋巴细胞、单核细胞和成纤维细胞组成［1］。结节病的病因和发病机制至今尚未被阐明，其临床表现异质性大，疾病进程难以预测。目前认为，结节病的发生是由于遗传易感者受到特定的抗原刺激，巨噬细胞或树突状细胞识别、提呈抗原，引起免疫应答过度激活，其中的免疫病理机制包括巨噬细胞功能改变、辅助性T 细胞1（T helper 1 cells，Th1）免疫反应过度激活、Th17/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）失衡等［2-3］。动物模型作为研究人类疾病的重要手段，能模拟疾病的发生发展，有助于阐明疾病的病因和发病机制。本研究着重就结节病动物模型的构建背景、构建方法及近年来相关研究概况作一介绍。

1 痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，P. acnes）

1.1P.acnes与结节病的临床联系P.acnes是寄生于皮肤与黏膜的一种革兰阳性无荚膜厌氧菌，可作为机会致病菌引起内源性感染。日本学者Ishige等［4］对来自结节病、结核和无淋巴结转移的胃癌患者的淋巴结进行P.acnes16S核糖体RNA基因测序，发现结节病患者淋巴结中P.acnes丰度远高于非结节病患者，提示P.acnes可能与结节病的发生相关。此外，P.acnes在结节病患者的肺、心脏、眼和皮肤的检出频率均高于非结节病患者［5-7］。Negi 等［8］通过电镜和P.acnes特异性抗原染色，发现结节病患者肺组织肉芽肿内含有缺乏细胞壁的Hamazaki-Wesenberg小体（HW 小体），且其P.acnes特异性抗原染色呈阳性，由此推测HW 小体是由细胞壁缺陷的P.acnes所形成。关于P.acnes的研究多来自日本，而中国与欧洲的研究也有相关报道：与非结节病患者相比，结节病患者的淋巴结内P.acnes丰度升高［9-10］；中国学者Zhou 等［11］分析65 例结节病和95 例非结节病（结核、肺癌和非特异性淋巴腺炎）患者淋巴结内P.acnes16S 核糖体RNA 拷贝数，以50.5 拷贝/毫升作为临界值进行结节病的诊断，其敏感度为73.8%，特异度为92.6%，曲线下面积为84.3%。这些研究结果提示P.acnes可能与结节病的发生相关。

1.2P.acnes动物模型及相关研究 McCaskill等［12］预先对C57BL/6 小鼠腹腔注射灭活P.acnes使其致敏，第14天予灭活P.acnes气管注射，于第21天诱导出沿支气管血管束分布的肉芽肿模型。肉芽肿以CD68+细胞为核心，周边CD4+T 细胞和B 细胞散在分布。此模型被多个研究者所采用［13-15］，后由Jiang等［14］改进，在预先腹腔注射使小鼠致敏后，分别于第14 和28 天气管注射灭活P.acnes，成功诱导出肉芽肿后继发纤维化的模型。研究结果显示，在重复气管注射灭活P.acnes后，小鼠肺部胶原沉积增加，I、III 型胶原蛋白表达升高，肺组织和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中转化生长因子β1 表达上调，提示肉芽肿进一步发展形成纤维化可能是持续的P.acnes刺激所致。经灭活P.acnes刺激的小鼠肉芽肿模型具备部分结节病的特征，如早期肺组织血管紧张素转化酶水平升高［12］，干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等Th1 细胞因子上调［12，14］，BALF中炎症细胞计数增加［12，14］，以及外周血和BALF 中Th17/Treg 比值上调［15］等。此外，姜丁源［16］以同样方法对白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）基因敲除小鼠进行灭活P.acnes刺激，但并没有观察到肉芽肿，提示在肉芽肿的形成过程中，IL-17A 是必不可少的关键因子。这个发现在Song等［15］的研究中也得到验证，尽管两者构建模型的方法略有不同——后者预先腹腔注射使小鼠致敏后，分别于第14、28 和42 天气管注射灭活P.acnes。Werner 等［17］从结节病患者淋巴结中分离出具有活性的P.acnes，随后在小鼠中予以单次气管注射，9 d 后诱导出肉芽肿模型。随后，该团队分别敲除髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和细胞色素b-245 β 链（cytochrome b-245 beta chain，CybB）基因，以同样方法进行P.acnes刺激，发现在两种基因敲除小鼠肺中均诱导出比野生型（wild-type，WT）小鼠更严重的肉芽肿炎症。与WT小鼠相比，MyD88基因敲除小鼠肺组织C-X-C 基序趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CXCL2 和IL-1α 表达减少，CybB基因敲除小鼠肉芽肿内巨噬细胞中有更多的P.acnes残留，提示肉芽肿的发生可能是MyD88通路介导的促炎信号通路缺陷，或CybB 通路产生活性氧减少而造成细菌清除能力受损所致。

此外，部分研究者采用灭活P.acnes皮下注射致敏，再予静脉注射灭活P.acnes激发免疫应答的方法制作肉芽肿模型。Ichiyasu 等［18］预先以灭活P.acnes加入弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant，IFA）进行皮下注射，再经静脉注射灭活P.acnes，在家兔中成功诱导出以上皮样巨噬细胞为中心的肺部肉芽肿模型。Kishi 等［19］以相同的方式制作小鼠模型，但结果显示肉芽肿病变多数在肝脏出现，而肺部极少，提示相对于小鼠而言，家兔对灭活P.acnes经静脉途径诱导的肺部免疫应答可能更为强烈［20］。同时，他们预先将经灭活P.acnes体外诱导成熟的树突状细胞与灭活P.acnes混合后进行皮下注射，再将上述混合物静脉注射入小鼠体内，结果表明相对于直接注射灭活P.acnes，此方法诱导的肺部肉芽肿数量增多、直径增大，且出现多核巨细胞，表明树突状细胞是启动肉芽肿细胞免疫的关键免疫细胞。

2 分枝杆菌

2.1 分枝杆菌与结节病的临床联系 Esteves 等［21］采用荟萃分析发现分枝杆菌［包含结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）和非结核分枝杆菌］和P.acnes都与结节病患病风险相关，比值比分别为6.8 和18.8，提示分枝杆菌也可能是结节病的潜在病原之一。曾有研究者在结节病患者的肺和淋巴结中检测到分枝杆菌DNA［22-23］。分枝杆菌特异性抗原，如超氧化物歧化酶A（superoxide dismutase A，sodA）、6 kD 早期分泌性抗原靶蛋白（early secreted antigenic target 6-kD protein，ESAT-6）、过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peroxidase，KatG）等，可以被结节病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和BALF 中的T 细胞识别并引起Th1型免疫反应［24-25］。Chen等［25］发现，相对于已接受治疗或处于非活动期的结节病患者，未经治疗并且处于活动期的患者BALF 中的T 细胞经分枝杆菌抗原刺激诱发的Th1 型免疫反应更加剧烈，提示这些对分枝杆菌敏感的T 细胞可能与疾病进展相关。Drake 等［26］进行了一项随机双盲安慰剂对照的多中心临床试验（CLEAR试验）以评估抗结核药物对结节病的疗效。该研究招募了97名患者，其中49名患者接受CLEAR 方案［前8 周左氧氟沙星500 mg/d，乙胺丁醇1 200 mg/d，阿奇霉素250 mg/d 和利福平600 mg/d（或利福丁300 mg/d），后8 周根据个人耐受度服用上述4 种药物中的2 种］，48 名患者接受安慰剂。结果显示，抗结核药物治疗除了减轻PBMCs 受ESAT-6 刺激而诱发的免疫反应外，对用力肺活量、6 min步行距离、圣乔治呼吸问卷评分等指标均无明显改善。尽管出现此阴性结果的原因可能是分枝杆菌并非结节病的病因的假设所引起，但研究设计中的方法缺陷也提供了可能的解释，如纳入患者处于疾病稳定期、服药时间不足、结局指标不敏感等。总之，目前的研究结果提示分枝杆菌在结节病的发病中可能起到一定的作用，但证据并不十分充足。

2.2 分枝杆菌动物模型及相关研究 目前多数研究采用MTB来源的抗原进行结节病样动物模型的构建。MTB直接感染动物被用于构建结核病模型［27-28］，而单纯MTB抗原可以用来制作结节病样非坏死性上皮样肉芽肿模型。Swaisgood 等［29］预先以20 μg sodA加入IFA 中，通过皮下注射使小鼠致敏，2 周后将sodA 与琼脂糖珠偶联并经静脉注射激发免疫应答。该实验的原理是琼脂糖珠和抗原偶联可以减缓抗原的降解，经静脉流经肺部毛细血管网时，由于琼脂糖珠不能通过毛细血管基底膜，因而形成微小栓塞驻留于肺间质中，其偶联的抗原得以持续激活肺部免疫应答［30］。该实验结果显示，小鼠肺内巨噬细胞围绕琼脂糖珠聚集形成肉芽肿结构。肉芽肿以巨噬细胞为核心，CD4+T 细胞和B 细胞散在分布，且存在少许多核巨细胞；BALF 中IL-2 和IFN-γ 表达升高，IL-4和IL-5 水平无变化，呈Th1 型免疫反应。此外，路聪哲［30］采用与Swaisgood 等［29］相似的造模方法（50 μg sodA，其余相同）构建小鼠模型，结果显示sodA 能够引起Th17/Treg 失衡及相关细胞因子IL-6、IL-17 表达升高。Zhang 等［31］也采用与前者等相似的造模方法（20 μg sodA，其余相同），7周后仍然能观察到散在的肉芽肿。此时肉芽肿由上皮样细胞构成，周围散在分布淋巴细胞和浆细胞；BALF 内CD4/CD8 比值升高；淋巴结中CD4+IFN-γ+T细胞比例升高而CD4+IL-4+T 细胞比例不变，符合Th1 型免疫反应。此外，Gonçales 等［32］以同样的方式（20 μg sodA）在正五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）基因敲除小鼠中进行sodA的刺激，结果表明巨噬细胞中PTX3的缺失能够引起C5a介导补体通路的异常激活，从而促进巨噬细胞代谢重编程，导致其增生、聚集。

Perez 等［33］将海藻糖6，6'-二霉菌酸酯（trehalose 6，6'-dimycolate，TDM）与矿物油VR6 混合后静脉注射入小鼠体内，于5 d 后诱导出肉芽肿炎症，于14 d后消退。该模型肺组织TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达升高，而IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、L-10 等Th1 和Th2 型细胞因子水平无变化。结合结节病患者肺泡巨噬细胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达升高这一研究报道［34］，上述结果提示该模型诱导的肉芽肿炎症可能处于极早期的巨噬细胞免疫应答阶段，后续的细胞免疫应答还未激活。Huppertz 等［35］将TDM 加入IFA 中静脉注射，1周后诱导出以巨噬细胞为核心的小鼠肺肉芽肿模型。结果显示肉芽肿内巨噬细胞高表达IL-1β；同时该研究在结节病患者肉芽肿内也发现IL-1β 和胱天蛋白酶1（caspase-1）表达升高。已知核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体通过激活caspase-1 促进IL-1β 的成熟和分泌［36］。该研究团队在NLRP3-/-小鼠（NLRP3 表达减少）和mir-223-/-小鼠（NLRP3 表达升高）中进行上述TDM 静脉注射，结果表明前者肉芽肿数量减少而后者数量增多，提示NLRP3/IL-1β 信号通路活性上调能促进结节病肉芽肿的发生。

3 外源性粒子

3.1 外源性粒子与结节病的临床联系 Beijer 等［37］的研究发现，结节病患者PBMCs 经金属（铝、铍、锆）或硅刺激后淋巴细胞增殖实验反应增强。淋巴细胞增殖试验和记忆淋巴细胞免疫刺激试验（memory lymphocyte immuno-stimulation assay，MELISA）用于评估患者对抗原的超敏反应［38-39］。Fireman 等［40］纳入13 例肺活检确诊为非坏死性肉芽肿患者（11 例结节病，2例慢性铍疾病）进行MELISA。结果显示9/13患者对至少一种金属（包括镍、钛、铬、铍等）的MELISA试验呈阳性反应。同时，Fireman 等［41］利用能量色散X射线谱对患者病理切片进行金属成分分析，发现在12/13 患者的肉芽肿内识别出至少一种金属的存在。这些结果均提示肉芽肿的出现可能与环境暴露相关。一项针对消防员的研究结果指出，与医务工作者和历史对照相比，消防员结节病平均年发病率和点患病率升高。此外，美国911 事件发生后，环境中可吸入颗粒物和环境污染物含量增多，Izbicki 等［42］发现，当地消防员结节病年发病率与往年相比显著升高，同样提示环境暴露在结节病发病中的重要作用。

3.2 外源性粒子动物模型及相关研究 多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）由燃料燃烧而成，广泛存在于室内和室外环境中，是空气中粒径小于2.5 μm 颗粒物（PM2.5）的组成部分［43］。Huizar 等［44］对小鼠进行气管注射MWCNT，病理结果显示肺部出现大量MWCNT 沉积，沉积物旁形成以巨噬细胞和CD3+T 细胞为主的肉芽肿；同时发现肺组织TNF-α、IL-18 等Th1 型细胞因子和C-C 基序趋化因子配体7（C-C motif chemokine ligand，CCL7）、IL-10、IL-13等Th2型细胞因子表达增加，呈现混合T淋巴反应。Mohan 等［45］收集MWCNT 模型小鼠肺泡巨噬细胞和结节病患者BALF细胞，分别以健康小鼠和健康志愿者为对照进行基因表达差异性分析，结果表明在MWCNT 模型小鼠及结节病患者中均发现适应性免疫通路、T 细胞信号转导通路、IL-12/IL-17信号转导通路和氧化磷酸化通路活性上调，提示MWCNT 模型小鼠与结节病患者具有相似的免疫特征。Mular 等［46］对小鼠进行MWCNT 和ESAT-6 气管注射。结果显示，相比于单独气管注射MWCNT，同时将MWCNT和ESAT-6气管注射入小鼠能诱导出更加严重的肺部肉芽肿炎症；且小鼠肺肉芽肿内纤连蛋白1 表达增加，出现胶原纤维沉积；BALF 内骨桥蛋白、CCL2、基质金属蛋白酶12 等促纤维化因子表达上调。该实验结果佐证了结节病可能是由多个病原引起的观点。此外，先前研究发现结节病患者的肺泡巨噬细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ）表达减弱［47］，因此该研究团队构建了条件性巨噬细胞PPAR-γ基因敲除模型，随后以相同方法在PPAR-γ基因敲除小鼠中进行MWCNT 和ESAT-6 气管注射。结果表明PPAR-γ缺乏能够促进ESAT-6 潴留，增加巨噬细胞中唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素F（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin F，Siglec-F）的表达，并促使IL-13、血小板源性生长因子A、转化生长因子β 等促纤维化因子表达上调，提示PPAR-γ在结节病纤维化进展中的重要作用。

4 转基因动物

Linke 等［48］在小鼠髓系来源细胞中条件性敲除结节性硬化复合症2（tuberous sclerosis complex 2，Tsc2）基因，激活巨噬细胞中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路，导致肺、淋巴结、肝中巨噬细胞肥大、增生和聚集。这些巨噬细胞表现出M2型极化的特点，其高表达半乳糖凝集素3（galectin 3）、几丁质酶样蛋白3（chitinase-like protein 3）等M2 型极化因子，低表达M1 型极化因子——诱导型一氧化氮合酶。将Tsc2基因敲除小鼠与WT 小鼠来源的巨噬细胞进行转录组分析，发现E2F 转录因子靶基因集在Tsc2基因敲除小鼠中高度富集。细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）能通过激活E2F 促使细胞周期由G1期向S 期转变［49］。该研究进一步发现Tsc2/mTORC1 通路通过激活CDK4 促进代谢重编程，同时该通路的异常激活能够抑制核因子κB 信号通路以及减缓细胞凋亡，进而导致肉芽肿的发生。该研究随后在结节病患者中进行验证，结果显示结节病患者肉芽肿内巨噬细胞高表达p-S6（mTORC1 激活标志）和Ki-67；同时分析一个纳入自限性和进展性结节病的肺组织数据集，结果表明进展性结节病肺组织中mTORC1 通路、E2F 通路及糖酵解通路活性上调，提示巨噬细胞中Tsc2/mTORC1信号通路异常激活促进肉芽肿的发生发展。

5 小结和展望

现有的动物模型是基于结节病可能的病因而构建的，但由于病因和发病机制不明，导致目前尚没有一个公认的结节病动物模型。在临床上，结节病的诊断需综合临床、影像和病理学资料进行判断，几乎所有结节病（除了Löfgren 综合征）的确诊均需提供病变区域非干酪样坏死性上皮样细胞肉芽肿的病理结果。因此病理观察到肉芽肿结构是目前评价结节病模型构建是否成功的金标准。

由于构建模型方法不完全一致，不同研究团队构建的动物模型组织学和免疫学特点不尽相同。（1）在组织学上，sodA诱导的肉芽肿内可见多核巨细胞，而单纯P.acnes诱导的肉芽肿内难以见到多核巨细胞，将诱导成熟的树突状细胞与灭活P.acnes混合后注射，方看到多核巨细胞的形成；MWCNT 诱导的肉芽肿内许多巨噬细胞形态为纺锤形，呈“漩涡样”生长；Tsc2基因敲除小鼠肉芽肿内的巨噬细胞胞体增大，胞质增多，体现出“过度肥大”的特征。（2）在免疫学上，P.acnes和sodA诱导的动物模型以Th1型免疫反应为主，BALF 内淋巴细胞比例增加，体现结节病患者以CD4+Th1 型淋巴反应为主的特点；TDM 诱导的小鼠肉芽肿炎症可能处于极早期的巨噬细胞免疫应答阶段；MWCNT 与ESAT-6 同时吸入小鼠模型佐证了结节病可能由多个病因引起的观点；sodA 静脉注射、重复P.acnes吸入和MWCNT 吸入的小鼠能诱导出持续时间较长的肉芽肿，其中重复P.acnes吸入小鼠和MWCNT 吸入小鼠模型肉芽肿内出现胶原沉积，体现肉芽肿后期进展为纤维化的特征；Tsc2基因敲除小鼠体现了结节病出现系统性肉芽肿（肺、淋巴结、肝、皮肤）的特征。现有的动物模型均有各自不足之处，如P.acnes诱导需要多次气管注射，可能增加操作的难度；TDM 诱导的小鼠模型只能引起为期10 d 的肉芽肿炎症［35］；MWCNT 吸入小鼠模型BALF内炎症细胞计数和淋巴细胞计数没有升高［44，50］，与结节病患者的临床表现不相符等等。

尽管目前的动物模型不能完全复刻结节病的特征，但它们为研究结节病的发生发展提供了许多新思路，如通过P.acnes小鼠模型发现IL-17A 在结节病肉芽肿形成中的重要作用；通过MTB 抗原小鼠模型发现PTX3缺失能够促进巨噬细胞增生、聚集，以及发现NLRP3/IL-1β 通路的异常活化与肉芽肿的形成相关；通过MWCNT 模型发现PPAR-γ 在结节病纤维化中的作用；通过Tsc2基因敲除小鼠模型发现巨噬细胞中mTORC1 的激活对肉芽肿的发生和维持具有重要作用等等。在动物模型的基础上，结合临床样本进行分析，有望进一步揭示结节病的发病机制。