miR-552和HSP90α与喉癌临床病理因素及预后的相关性研究

曾妮,高芳芳,王爱华,陈应超,卢岭,李鹏程

随着对喉癌发病机制研究深入,基因水平的标志物在喉癌病情及预后中因敏感度及特异度高而更具有临床价值[1-2]。miR-552具有调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化等功能,与多种恶性肿瘤发病机制、病情及预后密切相关[3]。研究发现miR-552通过靶向p53基因而促进喉癌细胞增殖及转移[4]。热休克蛋白90α(heat shock protein 90α,HSP90α)与恶性肿瘤发生、发展及转归密切相关,在多种恶性肿瘤中表达显著升高,可作为病情及预后评估的标志物[5]。研究发现喉癌患者血清HSP90α蛋白表达显著升高,可提高喉癌诊断的敏感度及特异度[6]。目前miR-552及HSP90α与喉癌临床病理因素及预后的相关性尚未明确,本研究对此进行探讨,为提高喉癌的临床诊疗水平提供客观证据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月—2017年1月武汉市第三医院耳鼻喉科诊治的喉癌患者87例为研究对象(LGC组),另选择同期喉良性疾病患者(声带息肉、慢性喉炎等)45例为对照(非LGC组),LGC组和非LGC组患者在性别、年龄、体质量指数(BMI)、美国东部肿瘤协作组(Eastern cooperative oncology group,ECOG)评分、吸烟史、糖尿病、高血压及家族史等比较差异无统计学意义(P均>0.05),具有可比性,见表1。本研究经武汉市第三医院医学伦理委员会审核批准(YLL071),全部患者或家属均知情同意并签署知情同意书。

表1 非LGC组和LGC组患者临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between non LGC group and LGC group patients

1.2 病例选择标准 纳入标准:(1)临床表现、影像学、病理组织学检查等确诊为喉癌;(2)首次起病,既往无喉癌相关病史,未行手术、放疗、化疗等相关治疗;(3)可配合本研究,随访过程中无脱落;(4)临床病理资料完整;(5)预计生存期≥6个月,ECOG评分≤3分。排除标准:排除合并严重心脑肺血管疾病、其他喉部良恶性肿瘤、神经精神疾病、严重肝肾功能异常等。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 组织miR-552和HSP90α表达检测:2组患者均行电子喉镜检查取病灶活检组织, 存于液氮中待后续检测。采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测miR-552和HSP90α表达,检测试剂盒购自武汉博士德公司(批号分别为20150623、20150418)。提取活检组织总RNA,逆转录为cDNA后行PCR扩增(美国ABI公司,型号为HT 7500),miR-552上游引物5’-GTTTAACCTTTTGCCTGTTGG-3’,下游引物5’-CGAACGCTTCACGAATTTG-3’;HSP90α上游引物5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。反应体系25 μl,反应条件为:50℃孵育20 min,95℃预变性1 min;56℃退火1 min,65℃延伸扩增45 s,共计35个循环,最后一轮72℃反应8 min。HSP90α选择β-actin为内参,miR-552选择U6为内参,采用2-△△ct法分别计算miR-552和HSP90α相对表达量。

1.3.2 随访情况:LGC组患者每3个月随访1次(电话或门诊),随访内容包括生存状况、预后状况,随访时间终点为2023年1月,统计患者生存期及预后状况(存活或死亡)。

2 结 果

2.1 2组组织miR-552和HSP90α表达比较 LGC组患者miR-552和HSP90α表达高于非LGC组患者,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 LGC组和非LGC组患者miR-552和HSP90α表达比较Tab.2 Patients in the LGC and non LGC groups miR-552 and HSP90 α Expression comparison

2.2 组织miR-552和HSP90α表达在不同临床病理因素中的差异 LGC组患者miR-552和HSP90α在性别、年龄、肿瘤部位和病理组织学类型方面比较差异无统计学意义(P>0.05),低分化、肿瘤最大径≥3 cm、有淋巴结转移及TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者miR-552和HSP90α表达高于中—高分化、肿瘤最大径<3 cm、无淋巴结转移及TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.01),见表3。

表3 LGC组患者miR-552和HSP90α表达在不同临床病理因素中比较Tab.3 LGC group patients miR-552 and HSP90 α Comparison of expression in different clinical pathological factors

2.3 组织miR-552及HSP90α表达预测喉癌患者死亡效能 绘制miR-552及HSP90α表达预测喉癌患者死亡效能的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示:miR-552、HSP90α及二项联合预测喉癌患者死亡效能的AUC分别为0.812、0.806、0.925,二项联合的AUC最大(Z/P=4.218/0.009、4.416/0.007),见表4、图1。

图1 miR-552和HSP90α 预测喉癌患者死亡ROC曲线Fig.1 miR-552 and HSP90 α Predicting the ROC curve for mortality in laryngeal cancer patients

表4 miR-552和HSP90α预测喉癌患者死亡的效能分析Tab.4 miR-552 and HSP90 α Efficiency analysis of predicting mortality in laryngeal cancer patients

2.4 喉癌患者死亡危险因素分析 以喉癌患者死亡为因变量(赋值:是为“1”;否为“0”),以上述结果中P<0.05项目为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示,miR-552≥1.7(赋值:<1.7=0,≥1.7=1)、HSP90α≥0.8(赋值:<0.8=0,≥0.8=1)、肿瘤分化程度低(赋值:中—高分化=0,低分化=1)、肿瘤最大径≥3 cm(赋值:<3 cm=0,≥3 cm=1)、有淋巴结转移(赋值:无=0,有=1)、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期(赋值:Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ+Ⅳ期=1)为喉癌死亡的独立危险因素(P<0.05),见表5。

表5 喉癌患者死亡多因素Logistic回归分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of mortality in laryngeal cancer patients

2.5 miR-552和HSP90α与喉癌生存关系 LGC组患者随访至随访终点时死亡64例,存活23例。miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8的喉癌患者中位生存期为(31.6±5.4)月,短于miR-552<1.7且HSP90α<0.8患者的(38.3±6.1)月 (Log-rank=7.412,P=0.003)。

3 讨 论

miR-552为位于染色体1p34.3上的小非编码RNA,其表达水平在多种恶性肿瘤的组织或细胞中显著上调。miR-552可以靶向多个基因,这些靶基因在基因转录和翻译、细胞周期进展、细胞增殖、凋亡、细胞迁移和侵袭等生物过程中发挥重要的调节作用。miR-552可与细胞色素P450家族2亚家族E成员1(CYP2E1)形成DNA-RNA杂交体并调节CYP2E1的表达,从而抑制肝细胞癌细胞核和细胞质中的转录和翻译。Han等[7]发现miR-552调节肝脏肿瘤起始细胞扩张和索拉非尼耐药。miR-552抑制Wnt抑制因子1(WIF1)的表达,并可调控胶质母细胞瘤细胞的细胞周期,miR-552诱导的WIF1表达下调可导致胶质母细胞瘤S期细胞数量显著减少,G1期细胞数量增加,从而抑制细胞生长和分化[3]。张明等[8]发现miR-552-3p通过抑制Dachshund家族转录因子1(DACH1)促进肝细胞性肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。越来越多的研究发现miR-552在卵巢癌、喉癌等多种恶性肿瘤中表达上调,与临床病理因素密切相关[4,9]。基于目前的研究进展,推测miR-552在恶性肿瘤中具有促癌基因功能。本研究中,喉癌患者miR-552表达显著高于喉良性疾病患者,进一步研究发现与肿瘤分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、TNM分期密切相关,证实miR-552与喉癌发病机制及临床病理因素存在关联。

HSP90α作为分子伴侣主要参与蛋白质新生肽链的正确折叠及稳定性,在恶性肿瘤细胞中维持多种促癌基因相关蛋白的稳定性,并抑制抑癌基因的蛋白合成,在细胞周期、增殖侵袭及上皮间质转化等多种生物学行为中具有重要调控作用[10- 11]。肿瘤细胞在应对热刺激及氧缺乏等应激反应时,热休克因子1会从与HSP90、共伴侣蛋白p23和含有TPR结构域的免疫亲和素形成的抑制复合物中释放出来,同时会三聚化迁移入核与HSP90上游的热休克元件结合而诱导HSP90的表达[12-13]。HSP90α在肿瘤中主要为促癌作用,通过促进促癌基因相关蛋白表达及抑制降解而参与恶性肿瘤发生、发展及转归[14]。崔翠莲等[15]检测发现非小细胞肺癌中HSP90水平异常增高且与病情及预后相关,在非小细胞肺癌的诊断及鉴别诊断中具有一定价值。刘斌等[16]发现单独检测HSP90α较CA125在胰腺癌临床分期中具有更高的特异度及敏感度。张芬等[6]检测喉癌患者血清HSP90α蛋白表达,发现HSP90α水平显著升高,可作为喉癌诊断的标志物。本研究检测喉癌患者HSP90α表达,发现HSP90α表达显著升高且与临床病理因素、死亡及生存期密切相关,提示HSP90α与喉癌病情及预后密切相关。

目前喉癌患者病情及预后评估主要依赖于MR检查及术后病理组织学TNM分期,存在敏感度、特异度低及普适性差等缺点,尤其不适用于无法行根治手术取得病理标本的进展期喉癌患者,不依赖于术后病理标本的检测,可能更具有临床价值[17]。随着对喉癌发病机制的深入研究及基因检测水平的提高,基因水平标志物在喉癌病情及预后评估中可能具有更高的敏感度及特异度而更具有临床应用价值[18-19]。既往研究发现miR-552和HSP90α在多种恶性肿瘤中水平显著升高且与病情及预后相关,可作为多种病情及预后评估标志物[20-22]。基于目前的研究及本研究发现推测miR-552和HSP90α可能在喉癌病情及预后评估中具有重要价值。本研究中,miR-552联合HSP90α预测喉癌患者死亡的效能较高,进一步研究发现miR-552≥1.7、HSP90α≥0.8、肿瘤分化程度低分化、肿瘤最大径≥3 cm、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期为喉癌死亡的独立危险因素,miR-552≥1.7且HSP90α≥0.8喉癌患者中位生存期显著缩短,表明miR-552和HSP90α在喉癌预后不良预测中具有重要价值,miR-552联合HSP90α检测可提高敏感度及特异度,临床上应密切检测喉癌患者miR-552和HSP90α,为喉癌诊疗决策制定提供客观证据。

综上所述,喉癌患者miR-552和HSP90α显著升高,与临床病理因素及预后密切相关,在喉癌患者病情及预后评估中具有重要临床价值,可作为喉癌病情及预后评估的标志物,但本研究为单中心研究且临床病例较少,喉癌患者miR-552和HSP90α与临床病理因素及预后的相关性亟需大规模临床试验证实。

利益冲突：所有作者均声明无利益冲突

作者贡献声明

曾妮:设计研究方案,实施研究过程;高芳芳:统计学分析;王爱华:实施研究过程,论文修改;陈应超:资料搜集整理;卢岭:分析试验数据;李鹏程:课题设计,论文撰写,论文审核