噬菌体在畜禽业中的应用研究进展

任仕航，段慧慧，杜向党，商艳红

（河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002）

抗生素是20 世纪科学技术史上最伟大的成就之一，拯救了无数生命。随着抗生素的残留问题以及长期滥用，一些对多种抗生素耐药的“超级细菌”迅速出现，由于新型抗生素的研发缓慢，细菌耐药性对人类和畜禽的生命构成了严重威胁。 据报道，每年至少有42 万人死于耐药病原体，并预计到2050 年将增加到1 000 万人［1］。 我国继2016年发布《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020年）》 后， 为进一步加强遏制微生物耐药工作于2022 年发布了 《遏制微生物耐药国家行动计划（2022—2025 年）》， 在行动计划中多次重点强调遏制微生物耐药工作的重要性， 研发新型抗菌药物迫在眉睫。因此，能够治疗细菌性感染的噬菌体已经成为替代抗生素的新的研究热点。

畜禽业是世界范围内使用多种抗生素的行业之一， 抗菌药物残留以及多重细菌耐药等问题给畜禽业的发展带来了重大挑战， 噬菌体作为抗生素的替代品， 在畜禽养殖业中具有广阔的发展前景。 本文主要综述噬菌体在畜禽业中的应用研究进展， 以期为噬菌体在畜禽业中的具体应用提供参考。

1 噬菌体概述

噬菌体在1915 年被发现并引起广泛关注，是一类可以感染细菌、真菌、放线菌以及螺旋菌等微生物的病毒统称，其广泛分布在环境中，是已知存在的最大病毒群，据估算总量可达1031个［2］。 根据噬菌体的形态结构特征，可以分为有尾噬菌体、无尾噬菌体以及丝状噬菌体， 噬菌体共分为15 个科，其中96%属于有尾噬菌体目，又可根据尾部形态结构分为短尾噬菌体科、长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科和阿克曼噬菌体科［3］。 根据噬菌体对宿主菌的破坏过程可分为裂解性噬菌体（又称烈性噬菌体或毒性噬菌体）和溶原性噬菌体［4］，裂解性噬菌体在Ca2+、Mg2+等二价阳离子的作用下特异性结合吸附在细菌细胞壁上［5］，将自身遗传物质注入细胞后， 在宿主菌的代谢系统下展开遗传物质复制、蛋白质合成和子代噬菌体装配等工作，在子代噬菌体达到一定数量后，噬菌体可以通过内溶素、穿孔素等裂解细菌细胞膜及肽聚糖层，在细胞内压的作用下细菌细胞破裂，从而释放子代噬菌体［6］。溶原性噬菌体是将自身基因组与宿主菌的DNA结合在一起，与细菌遗传物质共同复制［7］，当环境发生改变时，转变为烈性噬菌体裂解细菌。由于溶原性噬菌体可能会通过将一种细菌的遗传物质转移到另一种细菌导致抗生素耐药性的发生， 甚至会增加宿主菌的毒力，因此，溶原性噬菌体不适合直接用于治疗［8］。 也有学者认为除了这两种经典的噬菌体复制周期以外还存在慢性感染、 持续感染模式和伪溶原性感染等不同的感染模式［9］。

相对于传统的抗菌药物， 噬菌体的研发周期更短，投入成本更低，且具有更高的专一性、更强的增殖能力、更安全、更不易产生耐药等优点。 噬菌体根据本身的吸附部位以及受体菌表面受体结构的不同具有高度的宿主特异性， 使得一种噬菌体只会杀灭单一或同一亚型的致病菌［10］。 当一个噬菌体感染一个宿主菌后，能够分裂出大约100个子代噬菌体，可以渗透药物不能穿透的区域［11-12］，一次给药后连续有效，直至消灭全部宿主菌后排出体外。噬菌体疗法具有很高的安全性，在噬菌体疗法发展的百年历史以来，已被应用于多种人类细菌性疾病，其中包括对呼吸道内科疾病的治疗［13］。据报道，细菌对抗生素产生对抗的突变频率为10-5，对噬菌体产生对抗的突变频率为10-7［14］，细菌会通过成簇的规律间隔的短回文重复序列CRISPR相关蛋白系统抵抗噬菌体的入侵， 同时噬菌体也能够进化出相应的机制如表达anti-CRISPR 蛋白来对抗细菌的耐受性［15］。 可以说相比于抗生素对机体的作用，噬菌体对机体来讲是一种“活药”，在细菌与噬菌体相互作用时可以实现共同进化。

2 噬菌体在畜禽疾病治疗中的应用研究

噬菌体疗法是将筛选、 纯化和富集特定宿主致病菌的专属烈性噬菌体添加到被致病菌污染的介质中定向侵染并杀灭致病菌［16］。 事实上，早在20 世纪20 年代发现噬菌体之初就开始被用于治疗细菌性感染， 在抗生素出现后噬菌体的研究一度被搁置，如今由于超级细菌的不断增多，人们把目光转移到了噬菌体疗法上， 以期它能够成为一种对抗细菌耐药的抗生素替代疗法［17］。 目前噬菌体疗法已经可以普遍应用于防治畜禽致病性大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌等细菌感染性疾病。

2.1 大肠杆菌

禽致病性大肠杆菌可以诱发急性败血症、输卵管炎、 气囊炎等症状， 其病死率几乎高达100%［18］，对畜禽业的发展造成了巨大的损失。 大肠杆菌作为革兰阴性菌， 表面有一层较厚的荚膜多糖， 可以作为细菌的保护层使其免受来自外界的伤害， 同时可以使细菌逃避免疫系统的吞噬和补体的杀灭作用。 吕金晖等［19］从鸡粪中分离出了1 株大肠杆菌裂解性噬菌体， 研究发现其解聚酶Dpo70 能够特异性降解宿主菌表面的多糖， 同时通过实验发现在解聚酶Dpo70 的辅助作用下25%的血清对于大肠杆菌E.coli 111 的杀灭作用基本上达到了100%，这说明噬菌体的解聚酶能够通过降解宿主菌表面多糖来杀灭大肠杆菌。 Oliveira等［20］利用噬菌体制剂治疗某鸡舍的大肠杆菌感染性疾病，7 d 后死亡率明显降低，21 d 后该鸡舍的病鸡彻底痊愈且无复发。 李金敏等［21］从某养殖场粪污采样中提取到了一株大肠杆菌噬菌体Ф ECP2-1，随后利用该噬菌体对处理过的养殖水体和鸡粪中的宿主菌进行防控， 杀菌率达到99%以上， 这都很好地说明了噬菌体对于杀灭大肠杆菌具有良效。

2.2 沙门菌

沙门菌作为一种人兽共患病原菌， 在畜禽养殖中可导致多种疾病，同时也会通过污染禽蛋、肉等给人类的健康带来威胁。 由韩国CJ CheilJedang公司研制的沙门菌噬菌体产品BioTector， 是首个在动物饲料中取代抗生素， 用以防治鸡伤寒及鸡白痢沙门菌的噬菌体产品［22］。 沙门菌能够通过垂直传播，Henriques 等［23］将噬菌体喷洒到孵化时被沙门菌感染的蛋壳表面，与对照组相比，喷洒组中孵化的雏鸡关节炎症状有了显著的改善， 并且在8 d 后这些症状全部消失，这表明了噬菌体能够阻断沙门菌的垂直传播。 Nikkhahi 等［24］利用给小鼠口服灌胃噬菌体的方法来治疗沙门菌感染， 结果发现， 噬菌体治疗可以很好地避免小鼠被沙门菌感染， 尽管以环丙沙星为阳性对照也有同样的保护作用，但是小鼠的体重却有所降低，这表明与抗生素疗法相比， 噬菌体疗法不仅可以治疗沙门菌的感染，而且对动物无害。

2.3 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌在环境中的分布非常广泛，它是临床上化脓性感染中最常见的致病菌之一，也是乳腺炎、关节炎和局部脓肿的主要致病菌，其中奶牛乳腺炎是阻碍奶牛业发展最常见的疾病之一，据统计全球患有此病的奶牛约有30%［25］。目前临床上主要使用抗生素治疗该疾病， 但是在脓肿的乳腺中金黄色葡萄球菌会形成生物被膜， 进而影响抗生素的杀菌效果， 而噬菌体能够利用其裂解生物被膜的作用将其杀灭。 侯忠余等［26］以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 为宿主菌从奶牛养殖场污水中分离到1 株烈性噬菌体P65， 使用该噬菌体对宿主菌MRSA 2 和MRSA 24 处理48 h后， 宿主菌的被膜清除率分别高达91.3%和92.2%。李跃［27］在患乳腺炎的奶牛所在的污水系统中分离得到金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体， 通过建立小鼠乳腺炎模型并使用该噬菌体对其治疗，发现乳腺组织内细菌数量显著下降， 明显减少乳腺组织中淋巴细胞的渗出，缓解乳腺组织病变。噬菌体内溶素是噬菌体侵染宿主菌后期所释放的一种能够裂解细菌细胞壁肽聚糖的水解酶。 李晓妍等［28］制备了一种互穿网络温敏水凝胶，利用干态浸泡法负载金黄色葡萄球菌内溶素Lys84 获得载药水凝胶IPNT-Lys84，经过对其性能表征的测试试验发现与游离内溶素相比， 负载于水凝胶中的内溶素Lys84 拥有更长的发挥作用时间， 因此，IPNT-Lys84 水凝胶能够作为一种有前景的抗菌材料， 用于多重耐药金黄色葡萄球菌外伤感染的防治。

3 噬菌体在畜禽养殖中的应用研究

禁用饲料添加抗生素以来， 动物的生长生产性能受到明显影响， 大量研究表明噬菌体对畜禽肠道的物理屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障的影响都会对其生长性能产生积极作用， 进而提高家禽出栏率及优质肉品生产率［29-30］。

机体的肠道物理屏障包括黏膜上皮和肠道紧密连接等， 其中胃肠道的黏膜上皮形态结构能够影响营养物质的消化吸收， 绒毛高度与隐窝深度的比值升高则表明其消化吸收功能增强， 即机体的生长性能好［31］。 朱树娇等［32］在肉鸡的饮用水中加入噬菌体复合制剂，结果显示十二指肠、空肠、回肠的绒毛都比对照组显著增高， 隐窝深度均比对照组显著变深，其消化吸收功能显著增强。肠道上皮细胞之间通过紧密连接蛋白 （ZO-1、Occludins 和Claudin-1 等）连接，而紧密连接蛋白与肠道通透性及屏障结构密切相关［33］。 郝贺［34］从某鸡场污水中成功分离得到了1 株长尾烈性沙门菌噬菌体， 通过实验证明噬菌体能够阻止沙门菌对雏鸡小肠绒毛的正常结构形态损伤， 促进十二指肠和空肠紧密连接蛋白表达， 从而抑制沙门菌对肠道的感染。 唐路瑶［35］配制噬菌体鸡尾酒作为饲料添加剂饲喂肉鸡， 研究发现饮用过噬菌体鸡尾酒的肉鸡肠道上皮细胞的ZO-1 和Claudin-1 蛋白表达量显著上调。黏蛋白MUC-2 是主要覆盖于肠道表面黏液层的一种大分子糖蛋白， 可以保护和润滑肠道，在唐璐瑶［35］的试验中噬菌体鸡尾酒组与抗生素组相比，肉鸡空肠黏液蛋白MUC-2 的蛋白表达量显著提高， 这说明噬菌体能够增强肠道物理及化学屏障，维护肠道稳态。 据统计，70%的免疫系统通过肠道来发挥其免疫功能， 改善肠道的微生物多样性能够有效降低免疫或炎症反应，从而防止其对生长性能的影响［36］。在正常情况下，IgA、IgG、IgM 含量增多或者免疫器官指数增加都在一定程度上表明动物免疫体系更强［37］。 葛龙等［38］将噬菌体加入麻鸡的基础饲粮中发现其胸腺指数、 脾脏指数和法氏囊指数与对照组相比均有所提高，葛龙等［39］还将噬菌体制剂加入母猪的基础饲粮， 结果发现3 种不同剂量的复合噬菌体制剂均能在合理范围内提高母猪的IgA、IgG 和IgM含量。Hosseindoust 等［40］和曾永娣等［41］同样尝试将噬菌体添加到仔猪饲粮中， 结果均表明噬菌体的添加提高了仔猪肠道中的益生菌活性， 并且也都增加了仔猪平均日增重及料重比。

4 噬菌体在畜禽产品生物防控中的应用研究

畜禽产品在到达消费者餐桌之前， 整个食品链都易受到各种有害微生物的影响， 当前人们主要利用各种化学性的保鲜剂、 防腐剂等来最大限度避免食品被污染， 然而却无法完全解决其造成的食品安全检测难度高和营养成分缺失等问题。研究人员尝试使用噬菌体在畜禽养殖过程、 鲜奶和肉制品生产过程、 保藏运输以及销售等不同阶段进行生物防控，并取得了一定的进展。

肉类食品在生产过程中极易受到多种致病菌的污染，从而对人类的健康造成威胁，Hee 等［42］将沙门菌接种于生鸡胸肉中，随后接种混合噬菌体，结果显示生肉中沙门菌菌量呈显著降低的趋势。Zhou 等［43］从养猪场污水中分离出了一株多价广谱噬菌体EP10，在不同温度（4 ℃和28 ℃）条件下将该噬菌体接种于受大肠杆菌与沙门菌共同污染的牛奶中， 结果发现在不同温度条件下噬菌体在牛奶中都能够有效抑菌。 噬菌体也可以用于食品加工过程和销售期间的消毒。 加拿大麦克斯特大学的研究团队研制出了一种可以有效防止细菌污染的新型噬菌体灭菌喷雾， 该喷雾能够被应用于食品加工、包装和清洁，在其表面形成一种动态、连锁的灭菌反应，安全且高效［44］。 到目前为止，国外已经批准产生志贺样毒素的大肠杆菌、 单核细胞增生李斯特菌和沙门菌的噬菌体等14 种噬菌体产品用于食物的生物防治［45］。 虽然我国在食品领域暂无获批的噬菌体制剂， 但是国内学者从未停止在食品领域对噬菌体进行研究， 并取得了阶段性进展。Wang 等［46］从鸭子养殖场分离出了一株宽宿主谱毒性噬菌体fmb-p1，将其接种于提前注入沙门菌的鸭肉样品中， 结果发现经噬菌体处理后的鸭肉样品比未处理的鸭肉中的菌体含量显著降低， 表明该噬菌体对鸭肉中的沙门菌具有极好的裂解作用。 聂若男等［47］将噬菌体作用于已接种沙门菌的牛肉，研究发现在4 ℃和25 ℃的温度下沙门菌菌量都有显著下降， 该噬菌体在食品中表现出了良好的抑菌效果。 在当今提出减抗替抗的背景下，噬菌体这种新型抗菌药物的研发，为控制食源性病原菌提供新的切入点，极具发展潜力。

5 结语与展望

随着多重耐药菌的广泛流行， 新型抗生素的研发缓慢， 给畜禽业的发展带来了各种各样的威胁。目前抗生素的禁用愈发普及，畜禽养殖业和医疗等方面急需新型抗生素替代制剂， 而对噬菌体的研究很好地体现了它在预防及治疗细菌性感染疾病方面有巨大潜能，而且能够作为饲料添加剂提高畜禽的生长性能， 不仅能够为畜禽健康生长提供保障， 更能满足人们对畜禽产品的安全性的要求，这无疑使畜牧业的发展迎来了新的曙光。

同时，任何抗菌策略都存在利弊。噬菌体的高度宿主特异性限制了其裂解能力， 现有的研究表明可以通过筛选裂解谱较广的噬菌体颗粒提高杀菌效果， 噬菌体的宿主范围与尾丝蛋白有很强的相关性， 由于不同种属的噬菌体可以相互交换尾纤维基因， 因此可以利用基因工程技术改造噬菌体，从而拓宽其宿主范围，常见的应对方法还有配制噬菌体鸡尾酒来应对细菌的混合感染， 有研究表明这种方法还能够有效降低耐受菌出现的概率［48］， 虽然前文中提到噬菌体较抗生素产生细菌耐药的概率极低， 但是在噬菌体对抗细菌耐药机制的动态过程中同样也在影响其药效， 有部分研究人员将目光转移到了噬菌体裂解酶， 它是一种可特异性降解细菌表面多糖的噬菌体蛋白， 目前尚未发现有目标菌株耐受裂解酶的现象， 说明噬菌体裂解酶较全噬菌体疗法能够更加稳定的发挥功效。 要想使噬菌体顺利到达细菌感染部位发挥作用， 还应该考虑到噬菌体制剂的稳定性以及药代动力学， 首先在筛选时要选择对温度敏感性较低、耐酸耐碱度较高的噬菌体，同时要选择适宜的材质包装制剂，从而提高噬菌体的稳定性，而药代动力学是研究机体对药物处置的动态变化， 同一感染部位使用不同的给药方式效果就会不同，噬菌体在体内的各个部位的效价和停留时间也不同［49］，因此在应用于临床之前必须要根据噬菌体的药代动力学制定一套系统准确的方案， 从而使其达到最好的治疗效果。 已有的研究足以表明噬菌体在畜牧业发展中的优势性， 随着对噬菌体研究的不断深入以及基因工程技术的不断成熟，相信在不久的将来， 国家能够建立一套成熟的噬菌体商品化体系， 使这种新型抗生素替代品真正为畜牧业的发展和人类的健康提供有力保障。