饲料中粗脂肪超声提取快速测定方法的研究

高志存，高 芸，余舒宁，袁雪波，王 薇，万彬彬，崔惠娟

（1.云南省红河哈尼族彝族自治州动物疫病预防控制中心，云南 红河哈尼族彝族自治州 661199；2.云南省红河哈尼族彝族自治州农民科技教育培训中心，云南 红河哈尼族彝族自治州 661199；3.云南省红河哈尼族彝族自治州动物卫生监督所，云南 红河哈尼族彝族自治州 661199）

粗脂肪是饲料中重要的组成成分之一， 是动物生长发育必需的营养物质。 饲料中粗脂肪含量是衡量饲料质量的重要指标之一，因此，准确测定饲料中粗脂肪含量， 对评价饲料质量和指导饲料配方设计及优化具有重要意义［1］。 目前，饲料中粗脂肪含量测定方法包括索氏提取法（油重法）、残余法、滤袋法、快速溶剂萃取法等，但大多存在操作繁琐、耗时长等问题，难以满足大批量样品检测需求［2-8］。 超声提取技术是将超声换能器的振动在溶液中产生的空化等各种特殊作用， 用于待测样本化学成分提取工艺中， 促使样本中所含成分快速、高效率地溶入溶剂中的一项提取技术，具有快速、高效、方便、提取率高等优点［9］。 超声提取技术已广泛应用于中药、食品、油脂等特定成分提取和检测中， 但在饲料粗脂肪提取中的应用尚无报道［10-17］。

本文利用超声波特有的高频率以及超声波在媒质中高速传播的工作原理， 将其首次应用于饲料中粗脂肪的提取测定，以期建立一种能快速、简便、准确测定饲料中粗脂肪含量的方法，并分析比较超声提取法和索氏提取法在测定饲料粗脂肪含量的差异，以期为实际检测工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 饲料样品来源

饲料样品共计14 种， 包括草鱼膨化配合饲料、 仔猪前期配合饲料、 生长育肥猪前期配合饲料、生长育肥猪后期配合饲料、肉用仔鸡前期配合饲料、肉用仔鸡中期配合饲料、肉用仔鸡后期配合饲料、产蛋鸡育成前期配合饲料、产蛋鸡产蛋高峰期配合饲料、产蛋种鸡配合饲料、仔猪浓缩饲料、熊饲料、玉米、豆粕，来源于云南省红河哈尼族彝族自治州饲料生产企业和畜禽养殖场。 饲料样品按《动物饲料 试样的制备》（GB/T 20195—2006）用四分法缩减至500 g，粉碎后过40 目筛，混匀后装入样品瓶中备用。

1.1.2 主要试剂耗材石油醚（沸程30～60 ℃），购自重庆川东化工（集团）有限公司；海砂（含量不少于99.8%），购自天津市光复科技发展有限公司；定性滤纸（12.5 cm），购自杭州新华纸业有限公司；高型称样瓶（40 mm×70 mm），购自福州北玻实验仪器有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

CSM-1 型旋风式样品磨， 购自北京一轻研究院有限公司；AG-204 型电子天平， 购自瑞士梅特勒公司；101C-IIB 型电热鼓风干燥箱，购自上海实验仪器厂有限公司；SZC-101 型脂肪测定仪，购自上海纤检仪器有限公司；SK5200HP 型超声波清洗器，购自上海科导超声仪器有限公司；超声波脂肪快速测定仪（专利号：ZL 2021 2 1564314.6），笔者所在实验室自行研发。

1.2 试验方法

1.2.1 超声提取法

精密称取（2.000 0±0.000 5）g 饲料样品和2 g海砂于定性滤纸上，叠成滤纸包，用铅笔编号，装入称样瓶中，放入103 ℃烘箱中干燥4 h，取出放入干燥器中冷却至室温，称重后记为m1；将滤纸包转移至超声波脂肪快速测定仪的广口瓶中， 按一定液料比（V/W）加入适量石油醚，进行超声波处理。 超声提取结束后， 用30 mL 石油醚冲洗滤纸包，将滤纸包装入相应的称样瓶中，放入103 ℃烘箱中干燥1 h， 取出放入干燥器中冷却至室温，称重后记为m2。

结果计算：粗脂肪含量（%）=（m1-m2）/m×100；式中，m 为饲料样品的质量（g），m1为超声提取前恒重的滤纸包+称样瓶质量（g），m2为超声提取后恒重的滤纸包+称样瓶质量（g）。

1.2.2 索氏提取法

精密称取（2.000 0±0.000 5）g 饲料样品于定性滤纸上，叠成滤纸包，用铅笔编号，放入103 ℃烘箱中干燥4 h，取出装入滤纸筒架内，把滤纸筒放到脂肪测定仪中，置于回收位置；将铝杯编号，放入103 ℃烘箱中干燥1 h，取出放入干燥器中冷却至室温，称重后记为m1；在铝杯中加入50 mL 石油醚，放入托架上，移入脂肪测定仪加热板内，拉下压杆，将滤纸筒移至浸泡位置，接通冷凝水；打开电源开关，手握把下移，将试样降至铝杯底，55 ℃浸泡1 h； 将提把升至抽提位置，75 ℃抽提1 h；将提把升至回收位置，85 ℃回收15 min；回收完成后，将压杆抬起，取出铝杯，放入103 ℃烘箱中干燥1 h，移入干燥器中冷却至室温，称重后记为m2。

结果计算：粗脂肪含量（%）=（m2-m1）/m×100；式中，m 为饲料样品的质量（g），m1为恒重的空铝杯质量（g），m2为恒重的铝杯+滤纸包质量（g）。

1.2.3 超声提取工艺单因素试验设计

选择草鱼膨化配合饲料为试验样品， 设计单因素试验， 考查分析各因素不同水平对粗脂肪含量测定的影响，单因素试验设计见表1。 各影响因素各水平分别进行独立提取试验， 且每个试验分别设3 个平行样， 结果取3 次试验的平均值，用Origin 2019 软件绘图。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，以液料比、浸泡时间、超声时间、超声次数为研究对象，粗脂肪含量为考查指标，设计4 因素3 水平L9（34）正交试验，优化饲料粗脂肪超声提取工艺， 各正交试验均进行2次平行重复试验。 同时，利用Minitab 18 软件对正交试验结果进行直观分析和方差分析。

1.2.5 最佳超声提取工艺条件的试验验证

按正交试验优化后的最佳条件， 测定草鱼膨化配合饲料中粗脂肪含量， 并与索氏提取法测定结果进行比较，重复6 次，取平均值。

1.2.6 两种提取方法的比较

超声提取工艺确定后， 分别采用此工艺条件和索氏提取法测定13 种饲料样品中的粗脂肪含量，重复6 次，测定结果以“平均值±标准差”的形式表示。利用SPSS 18 统计学软件中配对样本t 检验法对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1 可知，随着液料比的增加，粗脂肪含量先逐渐增大后基本保持平稳。当液料比较低时，滤纸包不能完全浸泡在提取溶剂中， 滤纸包与提取溶剂接触不充分，空化效应弱，从而导致粗脂肪提取率低。液料比增加时，滤纸包与提取溶剂接触充分，空化效应增强，使粗脂肪提取率增加，因此，后续正交试验液料比选择25、37.5、50 mL/g。

图1 液料比对粗脂肪含量测定的影响

由图2 可知，随浸泡时间的增加，粗脂肪含量略有增加，但差距不大。为了使浸泡时间考查覆盖范围更广，所以后续正交试验中浸泡时间选择0、60、120 min。

图2 浸泡时间对粗脂肪含量测定的影响

由图3 可知，随着超声时间延长，粗脂肪含量呈先升高后保持平缓的趋势，而超声30、40、50 min时的粗脂肪含量测定结果基本一致， 为了考查超声30 min 时是否为粗脂肪提取的拐点，所以后续正交试验超声时间选择20、30、40 min。

图3 超声时间对粗脂肪含量测定的影响

由图4 可知，随着超声次数增加，粗脂肪含量呈先升高后平缓的趋势， 而超声次数为2、3、4、5次时的粗脂肪含量测定结果基本一致， 为了考查超声次数为2 时是否为拐点， 所以后续正交试验中超声次数选择1、2、3 次。

图4 超声次数对粗脂肪含量测定的影响

通过单因素试验分析各因素不同水平对粗脂肪含量测定的影响结果可设计正交试验各因素水平，正交试验因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素水平设计

2.2 正交试验和方差分析结果

由表3 和表4 可知， 各因素对饲料粗脂肪超声提取影响大小依次为： 超声次数>液料比>超声时间>浸泡时间；超声次数、液料比和超声时间均对饲料粗脂肪超声提取率具有极显著（P<0.01）影响； 浸泡时间对饲料粗脂肪超声提取率具有显著（P<0.05）影响。

表3 正交试验结果及直观分析结果

表4 方差分析

以k 值为依据， 各影响因素中k 值最大的组合A3B3C3D3是最优选择。 但是， 比较A2B1C2D3和A3B1C3D2组合的检测结果，二者相差不大，且在单因素试验中， 可以看出浸泡时间对粗脂肪超声提取影响不是很大，超声30 min 和超声40 min，超声2 次和3 次的检测结果相近。 故综合考虑检测成本、检测时间、准确性等因素，认为饲料粗脂肪超声提取的最佳工艺条件为：液料比37.5 mL/g，浸泡0 min，超声时间30 min，超声提取2 次。

2.3 最佳超声提取工艺条件的验证

按照“2.2”项下确定的超声提取最佳工艺条件，重复测定6 次，饲料中粗脂肪含量测定结果分别为：4.72%、4.68%、4.75%、4.83%、4.79%、4.77%，平均值4.76%。 同时，采用索氏提取法测定同一饲料样品粗脂肪含量，重复测定6 次，结果分别为：4.76%、4.77%、4.78%、4.77%、4.79%、4.74%， 平均值4.77%。 试验证明该工艺稳定且可行。

2.4 超声提取法和索氏提取法的比较

分别采用超声提取法和索氏提取法测定13种不同饲料样品粗脂肪含量， 两种方法测定结果基本一致， 符合 《饲料中粗脂肪的测定》（GB/T 6433—2006）中关于重复性的要求（≤0.25%），结果见表5。 由表6 可知，两种方法测定饲料粗脂肪含量差异不显著（P>0.05）。

表5 超声提取法和索氏提取法粗脂肪测定结果分析 单位：%

表6 超声提取法和索氏提取法的t 检验结果

3 讨论

3.1 海砂的使用

装有饲料样品的滤纸包， 放入广口瓶超声提取时，滤纸包漂浮在液面上，滤纸包与提取溶剂接触不充分，直接影响到超声提取效果。为解决这个难题，笔者进行了多方摸索。将装有饲料样品的滤纸包和1 个直径35 mm 的POM 球，装于同一个塑料网兜中，在放入广口瓶超声提取时，滤纸包全部浸泡在提取溶剂中，滤纸包浮在液体中上部，超声提取效果有所改善，但仍未达到预期目标，且易污染，操作不简便。 受水分测定时海砂使用的启发，将饲料样品和海砂混合，叠成滤纸包，放入广口瓶超声提取， 一方面滤纸包中的饲料样品通透性增加，与提取溶剂接触更充分，另一方面滤纸包沉于瓶底，不翻转、不移动，更接近超声波声源，从而使超声提取效果大大增强。

3.2 滤纸包的称量

滤纸包经溶剂超声提取、 干燥后很容易吸潮，称量过程中，在分析天平上很难平衡，读数不准，会对实验结果造成影响。本实验将滤纸包放入40 mm×70 mm 规格的高型称样瓶中进行称量，很好地解决了滤纸包在分析天平上读数不准的问题。 称样瓶规格不宜过小，否则滤纸包不便放入称样瓶中，即使放入后，多次拿取也易造成滤纸包破损。

3.3 超声提取后冲洗滤纸包

试验过程中发现，超声提取结束后，直接将滤纸包装入称样瓶中干燥称重， 超声提取法测得的粗脂肪含量值比索氏提取法测得值低。分析原因，是饲料中超声提出的少量粗脂肪吸附在滤纸包上，必须进行清洗。 超声提取结束后，用适量石油醚冲洗滤纸包， 再将滤纸包装入称样瓶中干燥称重， 所测得的粗脂肪含量值与索氏提取法测得值接近。

3.4 超声波清洗器的选择

目前超声提取方面的文献大多对超声功率、频率进行了优化，最佳超声功率多在250～540 W［18-27］，而实验室常用超声波清洗器的功率大多在200 W、40～60 kHz，为确保研发的饲料中粗脂肪超声提取快速测定方法可以用实验室常用的仪器设备自行组配检测， 在研发过程中就使用实验室常用功率的超声波清洗器进行试验。

3.5 超声提取法应用范围广

本实验中， 选用脂肪含量高的草鱼膨化配合饲料为试验材料，进行单因素和正交试验，确定出超声提取粗脂肪的最佳工艺条件。 再选用市场上常见的饲料原料（玉米、豆粕）及猪、鸡等动物性饲料产品用超声提取法测定粗脂肪含量， 并与索氏提取法进行比较， 结果显示超声提取法和索氏提取法测定饲料粗脂肪含量差异不显著 （P>0.05），表明本实验研发的超声提取法可用于饲料原料和常见动物性饲料产品的粗脂肪含量测定， 适用范围广。超声提取法所用设备可用超声波清洗器、广口瓶、冷凝管（球形效果更好）自行组配，1 次可测30 余个样品， 提取时间仅需1 h， 具有前处理简便、准确度高、速度快、成本低和溶剂损耗小等优点，适用于大批量样品的检测。而脂肪测定仪采用的是索氏提取法，需要专门的仪器设备，该仪器结构复杂，造价高，1 次只能测定6 个样品，提取时间至少需2 h［8-9］。

4 结论

本研究首次将超声提取技术应用于饲料原料和常见动物性饲料产品粗脂肪含量测定中， 采用正交试验优化饲料粗脂肪超声提取工艺， 其最佳提取工艺条件为液料比37.5 mL/g， 浸泡0 min，超声时间30 min，超声提取2 次。 研究表明，超声提取法与脂肪测定仪索氏提取法相比，1 次可多测5倍饲料样品，提取时间缩短1 半，成本低，测定结果差异不显著（P>0.05），适用于大批量样品的检测。