蒙药红花清肝13 味丸治疗CCl4 诱导小鼠肠道损伤的转录组测序分析研究

魏媛媛，红 梅，王海生

（内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110）

肠道不仅发挥对营养物质的消化吸收功能，还对维持体内环境稳态起重要调节作用。 肠道黏膜屏障能够阻止肠道内致病菌、 外来抗原和内毒素等的移位，防止机体受到侵袭，同时吸收机体所需的营养物质［1-2］。 研究表明，缺血、缺氧、感染性疾病、缺血再灌注损伤、内毒素水平增加、应激反应、胆汁、化学物质、电离辐射、肠道微生态紊乱等均可引起肠道损伤［3-5］。

蒙药红花清肝13 味丸又名古日古木-13，由红花、人工牛黄、麦冬、诃子、莲子、银朱、丁香、人工麝香、紫檀香、木香、川楝子、水牛角浓缩粉、栀子13 种药材组成， 主要成分红花具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、止痛、镇静、清除氧自由基、调节血脂、保护脑组织、扩张小动脉、增加组织血流量、抗纤维化、保护神经、改善机体微循环和提高免疫力等作用［6］。

笔者所在课题组前期研究发现， 蒙药红花清肝13 味丸对肝损伤具有保护作用［7］。 炎症、门静脉高压、 肠道微生物组成变化均可导致肠道通透性增加，致使内毒素移位，引起肝脏中多种促炎基因和细胞因子的转录激活。由于肠道屏障受损，大量细菌及其代谢物如脂多糖（LPS）通过肝肠循环进入肝脏。蒙药红花清肝13 味丸经肝肠轴进入体内，是否能够对肠道损伤起到保护作用？该研究通过建立小鼠四氯化碳（CCl4）肠道损伤模型，利用高通量转录组测序技术，筛选CCl4引起小鼠肠道损伤及蒙药红花清肝13 味丸治疗过程中涉及的重要信号通路及基因，以期为揭示红花清肝13 味丸预防及治疗肠道疾病的分子机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6～8 周龄雄性C57BL/6 小鼠18 只，体重20～22 g，购自北京维生河实验动物科技有限公司。 蒙药红花清肝13 味丸，购自内蒙古国际蒙医医院。 根据参考文献［8］中的计算公式，小鼠给药剂量根据该药物的成人日剂量50 mg/（kg·BW）推算，确定为616.5 mg/（kg·BW）。 CCl4﹑橄榄油﹑PBS﹑生理盐水购自上海阿拉丁公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分组及处理

将18 只小鼠随机分为3 组，每组6 只，分别为空白对照组、模型组和治疗组。空白对照组与模型组每天灌胃1 次生理盐水，剂量为10mL/（kg·BW），连续7 d； 治疗组小鼠每天灌胃1 次红花清肝13味丸，剂量为616.5 mg/（kg·BW），连续14 d；最后一次灌胃4 h 后，对照组腹腔注射橄榄油，模型组和治疗组腹腔注射CCl4橄榄油混合物（CCl4∶橄榄油=1∶4，V/V），剂量均为10 mL/（kg·BW）。 肠道损伤处理后第2 天， 将3 组小鼠用乙醚麻醉后安乐死（颈椎脱臼法）。 记录所有小鼠体重并取十二指肠组织。

1.2.2 转录组测序及数据分析

将十二指肠组织用RNase-free 水冲洗后吸干表面水分，放入液氮中速冻一段时间后置于-80 ℃冰箱中保存。 将组织样品送诺禾致源公司进行全基因转录组测序。 RNA 提取及质量检测合格后，进行Illumina 测序。 对于有生物学重复的样本，使用DESeq2 软件（1.20.0）进行2 个比较组合之间的差异表达分析。采用clusterprofile 软件对差异基因集进行KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。 KEGG 通路富集以padj小于0.05 作为显著性富集的阈值。

2 结果与分析

2.1 小鼠十二指肠组织的转录组测序结果

对小鼠十二指肠转录组测序， 差异表达基因聚类热图显示（见图1），空白对照组﹑模型组和治疗组肠道组织均能较好地聚在一起，其中，治疗组与空白对照组距离较近，而模型组与空白对照组距离较远。差异表达基因柱状图及火山图显示，与空白对照组相比，模型组差异表达基因数量为1 419个， 其中， 上调表达基因744 个， 下调表达基因675 个（见图2 及图3A）；与空白对照组相比，治疗组差异表达基因为2 875 个，其中，上调表达基因1 362 个， 下调表达基因1 513 个 （见图2 及图3B）；与模型组相比，治疗组获得了2 288 个差异表达基因，其中，上调表达基因1 139 个，下调表达基因1 149 个（见图2 及图3C）。

图1 不同组别小鼠十二指肠组织差异表达基因聚类热图

图2 不同组别小鼠十二指肠组织差异表达基因数量统计

图3 差异表达基因火山图

进一步对模型组差异表达基因进行KEGG 富集分析，发现B 细胞信号通路﹑破骨细胞分化信号通路﹑炎症性肠病信号通路﹑趋化因子信号通路及JAK-STAT 信号通路等被激活（见图4）。对治疗组差异表达基因进行KEGG 富集分析， 发现mTOR信号通路﹑FOXO 信号通路及长寿调节信号通路等被激活（见图5）；破骨细胞分化信号通路﹑细胞凋亡信号通路等被抑制（见图6）。

图4 CCl4 损伤肠道后被激活的信号通路

图5 红花清肝13 味丸治疗后被激活的信号通路

图6 红花清肝13 味丸治疗后被抑制的信号通路

2.2 转录组数据与蒙药红花清肝13 味丸药物靶点互交分析

为了寻找蒙药红花清肝13 味丸治疗CCl4致肠道损伤中发挥重要作用的基因， 经HERB 数据库搜集红花清肝13 味丸作用靶点基因，筛选出的靶点基因有143 个。对红花清肝13 味丸治疗后显著差异表达基因进行生物信息学分析， 发现下调基因有155 个。 将分析得到的两组基因群通过String 数据库进行蛋白质互作网络（PPI）分析，结果如图7、图8 所示。 进一步对两组关键蛋白互交分析， 得到药物靶点基因和转录组靶点基因的共靶点基因，从中筛选出在转录组数据中表达量存在显著差异的JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 基因， 结果如图9 所示。

图7 红花清肝13 味丸作用靶点基因

图8 RNA-Seq 蛋白互作网络图

图9 红花清肝13 味丸作用靶点与转录组靶点互交分析结果

3 讨论

肠道是机体重要的免疫系统之一， 人体免疫力与肠道密切相关。 肠道组织受损可引起多种疾病， 若不及时治疗可能会引起机体多器官功能障碍［9］。 研究表明，蒙药在肠道黏膜屏障损伤后的修复中有重要作用［10］。 目前蒙药在临床中的应用越来越广泛，许多蒙药能够改善肠道菌群失调，增强肠道黏膜免疫屏障功能，减轻肠道炎症反应，促进肠道黏膜损伤的修复［11］。 为了寻找更多的治疗靶点，近年来肠道组学测序研究越来越受到关注。在一项黄水多糖对Caco-2 细胞肠道屏障损伤的保护作用机制研究中，经转录组测序发现，表达差异显著的基因主要富集于MAPK﹑Toll 样受体和NFκB 等信号通路［12］。在C 型产气荚膜梭菌外毒素致小鼠肠道损伤的转录组分析中发现， 表达差异显著的基因主要富集在TNF、IL-17、p53、FOXO、Toll样受体和NF-κB 等信号通路［13］。

JAK-STAT 信号通路是真核细胞中重要的信号通路，当宿主发生细菌感染时，机体中IFN-γ 激活JAK，进一步磷酸化STAT1，活化的STAT1 转移到细胞核中，促进多种靶基因的转录。 JAK-STAT信号通路参与抗炎作用， 阻止致病菌或内毒素的入侵；同时也可以促进或加重机体炎症反应［14-15］。

mTOR 信号通路受多种细胞信号的调控。 研究发现，双歧杆菌可改善UC 小鼠的结肠损伤，增加肠道菌群的多样性， 这可能与激活VIP/cAMP/PKA 信号通路、抑制mTOR 信号通路有关［16］。 研究表明， 产肠毒素大肠杆菌K88 能够激活mTOR信号通路， 而丁酸梭菌能够通过介导mTOR 信号通路缓解产肠毒素大肠杆菌K88 感染IPEC-J2 细胞引起的炎症反应， 并提高紧密连接蛋白的表达量，从而减轻细胞损伤［17］。

FOXO 信号通路的激活对肿瘤发生、 寿命调节、代谢调节等具有重要作用。 Cheng 等［18］利用黏膜蛋白质组学技术和粪便微生物群移植方法研究了外源性微生物对产肠毒素大肠杆菌K88 感染仔猪模型肠道功能的影响， 发现FOXO 信号通路显著上调。 Zhang 等［19］研究表明，FOXO 信号通路主要参与模拟运输应激诱导的鸭肠道损伤机制。

NF-κB 抑制因子α（NFKBIA）参与调节NFκB 信号通路， 静息状态下NFKBIA 位于细胞质中， 当机体受到刺激时，NFKBIA 发生磷酸化，继而使NF-κB 从三聚体中释放出来并进入细胞核，调控下游基因转录及炎症因子的分泌。 改善肠道菌群的丰富度和组成比例， 可有效降低LPS 在肠道黏膜中的渗透， 使肠道组织中NF-κB 的表达水平下调，改善糖、脂代谢及炎性因子关键调控基因和调控蛋白的表达， 从而降低炎症反应程度，同时可改善胰岛素抵抗水平，最终调节机体物质代谢和炎症反应［20］。研究表明，CCl4可通过诱导MAPK/NF-κB 信号通路中相关基因的表达，促进炎症发生发展［21］。 同时，CCl4可诱导JUN 表达上调［22］。

4 结论

筛选出了参与小鼠CCl4肠道损伤及蒙药红花清肝13 味丸治疗过程的FOXO﹑mTOR﹑JAKSTAT 等重点信号通路和JUN﹑STAT1﹑NFKBIA、FOS 重点基因，为明晰红花清肝13 味丸预防及治疗肠道损伤的分子机制提供了参考。