60Co-γ 射线辐照对利咽含漱液中木犀草苷含量的影响*

施崇精，李 萍，王 隽，蒲秋易，李 瑞，肖佳佳

（四川省成都市中西医结合医院，四川成都 610095）

利咽含漱液由锦灯笼、冰片、硼砂、赤石脂、儿茶、甘草组方，有清热利咽、消肿止痛、凉血止血、收敛生肌功效，可用于治疗口咽部肿痛、溃疡、急慢性扁桃体炎等。辐照灭菌是利用γ射线，电子加速器产生的高能电子束，或者X 射线杀灭中药中微生物的方式，可降低药品生产过程中的微生物负载［1-4］。60Co-γ射线辐照是常用的药品灭菌方法［5-6］，为此，本研究中建立了高效液相色谱（HPLC）法测定方中君药锦灯笼药效成分木犀草苷的含量［7-9］，并进一步考察了不同剂量60Co-γ射线辐照对含量测定结果的影响。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；BP -211D 型电子天平（赛多利斯科学仪器＜中国＞有限公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

木犀草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111720-201810，含量93.5%）；利咽含漱液（医院制剂室提供，批号分别为210501，210701，210702，210703）；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/ V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：350 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

取木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇，制成质量浓度为47.385 µg / mL 的对照品溶液。精密量取样品2 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经0.45 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按利咽含漱液的处方及工艺制备缺锦灯笼的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性及专属性试验：取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，理论板数按木犀草苷峰计大于5 000，分离度均大于1.5，基线分离良好，且阴性对照无干扰，表明专属性良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.LuteolosideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取对照品溶液（质量浓度为47.385 8 µg/ mL），加甲醇稀释成质量浓度分别为1.895 4，4.738 6，18.954 3，28.431 5，47.385 8µg/mL的系列对照品溶液。精密量取10µL，按2.1项下色谱条件进样测定。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=31.13X-15.793（r=0.999 7，n=5）。结果表明，木犀草苷质量浓度在1.895 4～47.385 8 µg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限考察：取2.2 项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比（S/N）为3∶1 和10∶1 时的进样量作为检测限及定量限。结果分别为0.2 ng和0.4 ng。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6 次，记录木犀草苷峰面积。结果的RSD为0.58%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，1，2，3，6，9，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录木犀草苷峰面积。结果的RSD为1.26%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为210501）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果木犀草苷平均含量为19.857 0µg/mL，RSD为0.87%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取已知含量的样品（批号210501）1 mL，共9 份，分别置5 mL 容量瓶中，精密加入对照品溶液0.5，1，1.5 mL，各3 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定（辐照前后）

取3批样品，采用60Co-γ射线分别以6 kGy和10 kGy的剂量辐照，平行2次，即得辐照后的利咽含漱液样品。取辐照前（0 kGy）后样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算木犀草苷含量。结果见表2，可见，辐照后样品中木犀草苷含量明显减少，且减少程度与辐照剂量呈正相关。考虑批间差异、药材差异等的影响，利咽含漱液中木犀草苷的含量限度暂定为20µg/mL。

表2 辐照前后样品含量测定结果（μg/mL，n=2）Tab.2 Results of content determination of luteoloside in samples before and after irradiation（μg/mL，n=2）

3 讨论

随着药品监管力度的加强，医院制剂质量控制要求日益提升，逐步从定性分析提升到定量分析，在保证药品质量方面起到了积极作用［10-12］。利咽含漱液组方中，锦灯笼清热解毒、利咽，为君药；冰片清热止痛、消肿［13］，硼砂清热解毒，共为臣药；赤石脂收敛生肌［14］，儿茶收敛生肌、止血［15］，共为佐药；甘草清热解毒，缓急止痛，且能调和诸药，为使药。现代药理学研究显示，锦灯笼含生物碱、甾体类、黄酮及其苷类等多种成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性［16-17］。

木犀草苷为锦灯笼的药效成分，多采用HPLC 法进行含量测定。臣药冰片难溶于水，且受热易挥发，本工艺将冰片兑入冷却的水煎液后混悬使用，不涉及提取转移率的质量控制，后期拟采用薄层色谱法进行鉴别。臣药硼砂多采用滴定法测定含量，但制剂测定存在颜色干扰；佐药赤石脂无明确指标成分；佐药儿茶、使药甘草用量占比较小，且有效成分在水提液中转移率较低，在本色谱条件下难以有效测定，故均暂未纳入指标成分测定。

预试验中还分别对色谱柱、柱温、流速、检测波长、流动相进行了耐用性试验考察。色谱柱考察了Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）和Agilent Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 µm）；柱温考察了28，30，32 ℃；流速考察了0.9，1.0，1.1 mL / min；检测波长考察了345，350，355 nm；流动相比例考察了乙腈- 0.1%磷酸水溶液（19∶81、20∶80、21∶79，V/V）。结果木犀草苷含量的RSD均小于3%，表明该方法耐用性良好。

综上所述，本研究中建立的HPLC 法精密度高、重复性好、专属性强，适用于测定利咽含漱液中木犀草苷含量。但其含量经60Co -γ射线辐照后会大幅下降，对制剂的有效性影响较大，宜考虑其他灭菌方法。