高效液相色谱-电雾式检测器法测定托吡酯片中主要成分及杂质含量

2024-01-26黄小琴季大伟仇雅静孙枫涛

中国药业 2024年2期

黄小琴，季大伟，仇雅静，孙枫涛

（1. 江苏省泰州市药品检验院，江苏泰州 225300； 2. 江苏省泰州市中医院，江苏泰州 225300）

托吡酯为抗癫痫药，属γ- 氨基丁酸再摄取抑制剂［1］。临床常用于治疗单纯部分性、复杂部分性发作和全身强直- 阵挛性发作及婴儿痉挛症，也可用于预防偏头痛［2-5］。目前，多采用高效液相色谱-示差检测器（HPLC - RID）法测定托吡酯片中主要成分的含量，但该方法存在灵敏度低，仪器平衡时间长，进样量大等缺点［6-9］。电雾式检测器（CAD）响应值取决于进样时被检测物的绝对质量，灵敏度较好，广泛用于皂苷类、生物碱类、糖类、脂类化合物等无（或弱）紫外吸收组分的测定［10-16］。基于此，本研究中建立了测定托吡酯片中主要成分及杂质含量的HPLC-CAD 法，并与现行标准方法测定结果比较，为托吡酯片的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪、Corona Veo RS型电喷雾检测器（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；KH - 400KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；XSE205DU 型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

托吡酯片（西安杨森制药有限公司，批号分别为20200826，20200927，20210612）；托吡酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号为101061 - 201902，含量99.9%）；乙腈为色谱纯，盐酸（HCl）、甲酸、氢氧化钠（NaOH）、30%过氧化氢（H2O2）溶液均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18柱（150 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（35∶65，V/V）；流速：1.0 mL/ min；柱温：35 ℃；雾化温度：35 ℃；过滤常数：3.6 s；幂率：1.0；采样频率：10 Hz；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

取托吡酯对照品约10 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加流动相适量，超声（功率400 W、频率40 kHz，下同）使溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液。取样品20片，精密称定，研细，称取细粉适量（约相当于托吡酯25 mg），精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，定容，摇匀，即得供试品溶液。称取上述样品细粉适量（约相当于托吡酯250 mg），精密称定，置25 mL 容量瓶中，加流动相，超声使溶解，定容，摇匀，作为杂质供试品溶液；精密量取1 mL，置500 mL 容量瓶中，用流动相稀释，定容，摇匀，作为杂质自身对照溶液。以流动相作为空白对照溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性及专属性试验：精密量取2.2项下溶液各10µL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，杂质自身对照溶液相应吸收峰可较好反映有关物质供试品溶液中的检测成分。理论板数以托吡酯峰计大于3 500，分离度均大于1.5，拖尾因子小于1.2，且阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.TopiramateA.Reference solution B.Test solution C.Blank reference solution D.Test solution of impurities E.Self - reference solution of impuritiesFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：称取托吡酯对照品适量，精密称定，用流动相溶解并制成含托吡酯1 mg/mL 的溶液。精密量取适量，分别用流动相稀释成约含托吡酯1.0，0.5，0.2，0.1，0.05 mg/mL 的系列对照品溶液。精密量取适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以待测成分质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y= 1 247.514 4X+114.499 8（r=0.995 6，n=5）。结果表明，托吡酯质量浓度在0.05～1.0 mg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限考察：取质量浓度为0.05 mg/mL的对照品溶液适量，倍比稀释，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以信噪比（S/N）约为10 和3 时的待测成分质量浓度为定量限和检测限，结果分别为3µg/mL和1µg/mL。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果的RSD为0.51%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，12 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.01%（n= 4），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

破坏性试验：取托吡酯对照品约10 mg，精密称定，共5 份，分别置20 mL 容量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，分别进行以下操作。1）碱破坏，加入0.1 mol/mL NaOH 1 mL，室温放置4 h，用0.1 mol/mL HCl 1 mL中和，用流动相稀释，定容，摇匀。2）酸破坏，加入0.1 mol/mL HCl 1 mL，室温放置4 h，用0.1 mol/ mL NaOH 1 mL 中和，用流动相稀释，定容，摇匀。3）氧化破坏，加入30%H2O2溶液1 mL，室温放置4 h，用流动相定容，摇匀。4）光照破坏，4 500 lx照度下光照4 h，用流动相定容，摇匀。5）高温破坏，取托吡酯对照品置烘箱中105 ℃加热4 h 后，加流动相适量使溶解，定容，摇匀。精密量取各破坏试验溶液10µL，分别按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。各破坏试验下产生的杂质峰均能与待测成分色谱峰达到有效分离，对测定无影响。详见图2。

图2 破坏性试验高效液相色谱图1.TopiramateA.Oxidative damageB.High - temperature damage C.Acid damage D.Alkali damage E.Light damageFig.2 HPLC chromatograms of damage test

重复性试验：取样品（批号为20200826）细粉适量，共6 份，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果托吡酯的平均含量为98.42%，RSD为0.85%（n=6）。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20200826）细粉适量（约相当于托吡酯12.5 mg），共9 份，分别置50 mL 容量瓶中，再分别按比例精密加入相当于托吡酯含量80%，100%，120%的托吡酯对照品，再分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品及杂质含量测定

取3 批样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液和有关物质供试品溶液，各2 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，按外标法计算托吡酯含量，同时将测定结果与原国家食品药品监督管理局国家药品标准收载的HPLC-RID 法进行比较，结果见表2。按自身对照法计算杂质供试品溶液含量，结果见表3。

表2 样品含量测定结果（%，n=2）Tab.2 Results of content determination of topiramate in samples（%，n=2）

表3 杂质含量测定结果（%，n=2）Tab.3 Results of content determination of impurities（%，n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

预试验中考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈- 0.2%甲酸水溶液和乙腈- 0.1%三乙胺溶液4个流动相系统，发现托吡酯在酸性系统中响应值最大，在水中其次，在碱性系统中最小，故选择乙腈- 甲酸溶液系统，根据响应值、基线等情况，最终选择乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相。

3.2 CAD 参数的选择

预试验中分别考察了雾化温度为55 ℃和35 ℃对检测响应值的影响，结果表明，检测灵敏度会随着雾化温度的提高而降低，故最终选择35 ℃。幂率是CAD 所特有的线性校正参数，不同的化合物具有不同的最优幂率。分别考察了不同幂率（0.9，1.0，1.1）对线性的影响，结果发现，随着幂率的增大，r也不断增大，但响应值不断降低，综合考虑线性和响应值的影响，最终选择幂率为1.0。