硫氧还蛋白还原酶小分子抑制剂研究进展*

王艳茹,王晓玲,段东柱

(宝鸡文理学院 化学化工学院,陕西省植物化学重点实验室,陕西 宝鸡 721013)

目前,癌症的发病率逐年增长,越来越多的癌症病人遭受着病痛的折磨,且癌症本身容易复发,传统的化疗方法对人体不可避免地产生毒副作用,寻找疗效显著的抗肿瘤药物迫在眉睫。天然产物具有安全、副作用小等优点,在过去的几十年中,科学家们已经从天然产物中发现了多种新的治疗小分子,并且提出了用于癌症治疗的药物新靶点[1]。

大量研究报道,硫氧还蛋白(Trx)氧化还原系统的表达水平与肿瘤细胞生长和存活有直接关系,许多化学小分子通过诱导活性氧水平的上升杀死肿瘤细胞,肿瘤细胞耐药表型与抗氧化酶和Trx活性的增加密切相关[2]。因此,作为一种新的抗癌治疗方式,干扰氧化还原稳态从而诱导氧化应激介导的细胞凋亡具有巨大的潜力。

1 Trx系统

Trx系统由Trx、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)组成。

1.1 Trx

Trx具有抗氧化作用,最早是作为核苷酶的供体被人们认识。Trx广泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳动物中[3],可以抵御细胞死亡导致的氧化应激,在氧化还原系统中有重要的作用。Trx的巯基和二硫键位于其保守的活化区域内,Trx的氧化还原活性使得其在细胞内具有不同的功能。Trx由α螺旋和β折叠连接而成,其分子量约为12 kDa,具有极高的热稳定性。哺乳动物Trx的存在有3种方式:Trx1分布于细胞核和胞浆中;Trx2分布于线粒体中;Trx3在睾丸中高度表达。

1.2 TrxR

TrxR是Trx系统的主要组成部分,它是一种同源二聚体黄素蛋白。TrxR是一种具有广泛底物特异性的酶,可以还原几种不同的氧化底物。除了利用氧化Trx作为底物外,其他底物有蛋白质二硫异构酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢、脂质氢过氧化物、维生素K、泛醌、核桃酮、茚三酮、四氧嘧啶、脱氢抗坏血酸、硫辛酸/脂酰胺、S-亚硝基谷胱甘肽、亚硒酸盐、甲基硒酸盐、硒代半胱氨酸和二苯硒化物。TrxR作为目前已知唯一可以还原Trx的酶,由于TrxR碳末端的硒半胱氨酸(Sec)具有较低的pKa值,故其具有非常高的活性,容易和亲电试剂发生迈克尔加成反应,并且TrxR和Trx在恶性肿瘤中高度表达,所以TrxR十分适合用来作为抗肿瘤药物的靶点。

2 Trx系统与肿瘤的关系

Trx系统是细胞内十分重要的抗氧化系统,可以维持细胞内的氧化还原平衡,有效预防细胞产生氧化应激。根据癌细胞发展的不同时期,Trx系统发挥的功能也不同[4]。在癌症早期,Trx可以抵挡由于致癌物引起的氧化应激,有助于防御癌症。但是当细胞开始表现出癌症表型时,由于Trx可以促进细胞生长、抵抗细胞凋亡,这时高水平的Trx将会有助于癌细胞的生长[5]。在癌症发展的后期,Trx可能会与肿瘤血管的生成、转移以及扩散相关。Trx系统通过电子的传递将硫氧还蛋白还原酶从还原态变为氧化态,氧化态的硫氧还蛋白还原酶还原二硫键生成抗氧化的巯基,从而维持氧化还原的平衡。从实验研究和临床观察中积累的数据表明,Trx/TrxR的表达和功能与多种疾病的发生有关,如衰老相关疾病、心血管疾病、癌症以及传染病等,因此,Trx系统在疾病的治疗中具有重要意义。

3 TrxR小分子抑制剂

近些年来,已经发现了许多从天然产物中分离得到或者合成的TrxR小分子抑制剂,并且已发现的TrxR抑制剂大多都具有抗肿瘤活性。本文总结了2017年以来具有代表性的TrxR抑制剂,可以分为天然产物(图1,化合物1-16)和合成的小分子(图2,化合物17-27)。

图1 从天然产物中分离得到的硫氧还蛋白还原酶抑制剂Fig. 1 Natural products as thioredoxin reductase inhibitors

图2 合成的硫氧还蛋白还原酶抑制剂Fig. 2 Synthetic inhibitors of thioredoxin reductase

3.1 从天然产物中分离得到的小分子抑制剂

豆甾醇(1)是一种植物甾醇,可诱导多种癌细胞系氧化应激介导的凋亡。RAJAVEL et al[6]研究发现豆甾醇对A549细胞生长有较强的抑制作用,可以引起活性氧水平升高,并且豆甾醇与TrxR活性位点的丝氨酸残基有着十分稳定的相互作用。豆甾醇可以靶向TrxR并引起A549细胞的氧化应激,最终导致细胞大量凋亡。菜蓟苦素(2)具有5-7-5融合三环骨架,具有2个羟基,4个外烯烃和6个立体中心。研究发现菜蓟苦素具有显著的抗肿瘤活性[7],菜蓟苦素的α、β-不饱和羰基通过抑制TrxR影响硫氧还蛋白通路,促进氧化Trx积累和活性氧介导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡。土木香内酯(3)是一种倍半萜内酯,YIN et al[8]发现土木香内酯在体内外均可抑制三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中TrxR1的活性,从而抑制TNBC细胞生长,使得细胞内活性氧增加引起细胞凋亡。ZHANG et al[9]从青木香中分离到一种含有α-亚甲基-γ-内酯的倍半萜内酯桑塔马林(4),研究发现桑塔马林是一种新型TrxR抑制剂,其靶向细胞内TrxR促进活性氧积累,从而抑制HeLa细胞增殖,TrxR在细胞内的敲低或过表达分别加重或减轻了桑塔马林对HeLa细胞的细胞毒性。天然产物羟基酪醇(5)属于多酚类化合物,也是TrxR1的有效抑制剂[10]。羟基酪醇抑制TrxR1可抑制细胞增殖,导致人结直肠癌细胞活性氧积累,诱导细胞G1/S周期阻滞引起细胞凋亡。海松烷二萜(6)是从北极真菌Eutypellasp. D-1中分离出来的一种衍生的吡玛烷二萜,对许多癌细胞显示出较高的细胞毒性。通过研究其对人胰腺癌细胞的抗癌作用发现,海松烷二萜可以促进胰腺癌细胞凋亡[11]。机制研究表明,海松烷二萜对Trx系统有抑制作用,但对谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽影响不大,海松烷二萜通过偶联Trx1中32位和35位的半胱氨酸(Cys32/Cys35)残基和TrxR的Sec498残基,导致细胞内谷胱甘肽水平降低和下游ASK1/JNK信号通路激活。WEN et al[12]研究表明,毛壳素(7)通过抑制TrxR1,随后诱导细胞内ROS过度积累使得PI3K/AKT通路失活,最终导致胃癌细胞死亡。一叶秋碱(8)是植物叶底珠中主要的活性生物碱内酯,在治疗神经系统疾病方面有着重要作用。ZHANG et al[13]报道了一叶秋碱在细胞中抑制纯化的TrxR,引起活性氧的积累,氧化谷胱甘肽和Trx的升高,破坏氧化还原稳态,最终导致氧化应激介导的HeLa细胞凋亡。PENG et al[14]发现从生姜中分离出来的姜皂苷(9)具有较好的抗肿瘤活性。姜皂苷可以通过抑制TrxR的活性提高HeLa细胞内活性氧水平使得细胞凋亡,敲除TrxR可以增加姜皂苷的细胞毒活性。KALIN et al[15]发现地衣次生代谢产物vulpinic acid(10)可以诱导TrxR1表达,同时抑制其蛋白表达和酶活性,是一种潜在的TrxR抑制剂。β-拉帕酮(11)从具有癌症化学预防属性的重蚁木树皮中获得,ZHANG et al[16]发现β-拉帕酮通过抑制TrxR并进一步升高氧化应激诱导HL-60细胞凋亡。从木香中分离得到的木香内酯(12)可以与TrxR 498位的Sec共价结合,抑制TrxR的生物学功能,对细胞产生毒性从而诱导细胞凋亡[17]。从五角葡萄内生真菌中分离得到的格孢苝醇(13)通过靶向TrxR抑制人肝癌HepG2细胞生长,从而导致DNA损伤、G2/M细胞周期阻滞和线粒体裂变,最终诱导细胞铁死亡[18]。本课题组[19]研究发现天然二萜类化合物毛萼乙素(14)可以共价修饰谷胱甘肽,并且通过靶向TrxR的Sec残基选择性抑制其活性;具有显著生物活性的倍半萜类化合物去氧地胆草素(15)可以抑制TrxR活性而诱导活性氧介导的HeLa细胞凋亡,下调细胞内TrxR可以显著增加细胞对去氧地胆草素的敏感性[20]。青藤碱(16)是临床药物正清风痛宁的有效成分,可以用来治疗类风湿性关节炎;青藤碱是一种新的TrxR抑制剂,并且在体内外对肿瘤细胞的增值和生长都有抑制作用[21]。

3.2 合成的小分子抑制剂

水杨酸作为抗炎药物阿司匹林的前体分子,也具有抗炎作用。水杨酸盐是一种多功能配体,具有2个硬碱性和强碱性给电子体,可促进阳离子的螯合或金属桥接。近几十年来,越来越多的研究认为钌(Ru)配合物对于治疗癌症有很大的贡献,目前已有3种Ru配合物进入临床试验阶段。CHEN et al[22]合成并表征了3种以水杨酸盐为配体的Ru(II)配合物,发现化合物(17)[Ru(phen)2(SA)]对肿瘤细胞具有明显的活性,而对正常细胞株BEAS-2B具有较低的毒性。研究发现化合物14在G0/G1期通过诱导细胞凋亡和触发细胞周期阻滞发挥抗癌作用。化合物14可选择性抑制Trx活性,促进活性氧的产生和积累,进而引发线粒体功能障碍和DNA损伤,最终导致人类非小细胞肺癌A549细胞凋亡。姜黄素可诱导癌细胞中不依赖caspase的程序性细胞死亡,但是其生物利用度和药理动力学较差。CHEN et al[23]开发了一种新的姜黄素类似物(18)[1,5-双(2-甲氧基苯基)五-1,4-二烯-3-酮],它可以抑制人类非小细胞肺癌细胞,还通过内质网应激介导的凋亡通路对肺癌细胞具有抑制作用,同时对正常细胞没有任何可观察到的毒性。HAN et al[24]发现依鲁替尼(19)对各种B细胞恶性肿瘤有临床活性,并且依鲁替尼可以通过不可逆地抑制哺乳动物硫氧还蛋白还原酶来抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长,从而引起活性氧升高、细胞凋亡。据报道,天然产物胡椒龙胺和川芎嗪通过上调活性氧水平对许多癌细胞有抑制生长作用。QIAN et al[25]发现一种新型胡椒龙胺/川芎嗪衍生物(20),并研究了其体内外药理作用。其在耐药Bel-7402/5-FU细胞中表现出抑制TrxR活性,增加活性氧水平,降低线粒体跨膜电位水平,发生DNA损伤和自噬,并且呈现浓度依赖性。YE et al[26]观察并证实了乙烷硒啉(21)是逆转对顺铂耐药的白血病K562细胞的有效途径。乙烷硒啉可特异性抑制TrxR活性,导致核因子κB (NF-κB)活性降低、Bax上调和Bcl-2下调。乙烷硒啉通过抑制TrxR而使顺铂耐药的K562细胞中活性氧水平升高。酚嗪是一种含氮杂环化合物,其作为一种抗癌分子被广泛报道。LIAO et al[27]对其类似物(CPUL1,22)具体的靶点进行研究发现,CPUL1可以和TrxR特异性结合,并且CPUL1在Trp-114,Val-118,Ala-495和Sec-498残基之间形成了一个稳定的疏水区域。HU et al[28]设计并合成了一系列含硒tepotinib衍生物,并发现大多数含硒杂化体对c-Met和TrxR表现出强烈的双重抑制活性。其中化合物8b(23)对人肝癌MHCC97H细胞的活性最强,半数抑制浓度(IC50)值为10 nM。通过对其作用机制的研究发现,化合物8b在G1期触发细胞周期阻滞,并通过靶向TrxR引起活性氧积累,最终导致细胞凋亡。NI et al[29]建立了发现TrxR1抑制剂的高通量筛选试验,并发现硫柳汞(24)是TrxR1的一种新型抑制剂。MENG et al[30]以胡椒龙葵胺为原料,设计合成了一系列单亚甲基环己酮和二亚甲基环己酮衍生物,并评价了其体内外药理性质。其中化合物4f(25)表现出最高的抗癌效力,4f对TrxR的抑制作用比胡椒龙葵胺几乎高出10倍。此外还发现4f可以增加活性氧水平,并且在体内对乳腺癌实体瘤也表现出较强的抑制作用。HE et al[31]报道了一系列bayis-hillman加合物的设计和合成,并鉴定了一种典型的加合物5f(26),该加合物对HepG2细胞具有优于其他类型癌细胞的细胞毒性。生物学研究表明,所选择的加合物将细胞周期阻滞在G1/G0期,并且选择性地靶向HepG2细胞中的TrxR,从而导致细胞内氧化还原稳态的崩溃。DONG et al[32]报道了一种新型TrxR抑制剂Au-24,可以通过降低线粒体膜电位和增加活性氧水平来抑制HepG2细胞的增殖,从而引起氧化应激、DNA损伤、自噬、细胞周期阻滞和凋亡。PACMA 31(27)的丙胺片段与TrxR的硒化半胱氨酸残基共价相互作用[33],选择性地抑制细胞中的TrxR活性,并进一步刺激低浓度下细胞内活性氧的产生,从而引发氧化硫氧还蛋白和氧化谷胱甘肽在细胞中的积累,诱导氧化应激介导的癌细胞凋亡。

4 展望

据报道,高水平的TrxR/Trx可在维持细胞表型的同时增强肿瘤增殖和侵袭,并与临床耐药性拓扑放化疗相关,因此Trx系统很有可能是肿瘤治疗的靶点。近年来研究表明,调节氧化还原机制对于治疗特定肿瘤细胞有重要的作用,基于这一发现,我们认为特异性调节或干预氧化还原信号转导途径的分子在临床的癌症治疗中显示出巨大的潜力。调节或干扰氧化还原信号通路的分子在各种疾病的临床研究以及临床研究前期中显示出巨大的前景。高度保守的Trx系统无处不在,参与各种细胞过程。它是细胞内主要的抗氧化防御系统,不仅调节细胞内氧化还原稳态,还影响能量代谢、调节免疫反应、控制细胞生长和存活,在调节细胞凋亡相关途径中起着关键作用。尽管Trx/TrxR抑制剂作为多种疾病的治疗药物已引起广泛关注,但该领域的未来研究仍存在一些挑战。研究Trx/TrxR抑制剂的候选药物和治疗策略,进一步开发调节活性氧稳态的小分子用来治疗癌症有很广阔的应用前景和重要意义。