基于主要农艺性状的25份凉粉草种质资源遗传多样性分析与综合评价

兰秀 阮丽霞 马仙花 杨海霞 李恒锐 梁振华 黄小娟 张秀芬 周春衡

关键词：凉粉草；种质资源；农艺性状；遗传多样性；综合评价

凉粉草（Mesona hLnensis Benth.）又称仙草、仙人草、仙人冻等，是唇形科凉粉草属的草本宿根型植物，原产于中国南部、印度和马来西亚等地，在我国主要分布于浙江、江西、贵州、广东、福建、广西、台湾等地区。凉粉草具有很高的营养和医药价值，是一种药食同源的植物。《中药大辞典》中介绍凉粉草具有清暑解渴、凉血之功效，能够治疗中暑、热毒、消渴、高血压、肾脏病、糖尿病、关节肌肉疼痛等。现代医学研究发现，凉粉草还具有美容养颜、补充维生素、提高免疫力等作用。凉粉草也是很多食品工业和化学工业产品的重要原料：例如，凉粉草的枝叶经水煮可提出凉粉草胶用于制龟苓膏、仙草冻、仙草露、仙草胶等；目前市场上流行的80%的凉茶饮料都是以凉粉草为主要原料。凉粉草还可用来提取咖啡色色素，还是一些草本洗面奶、沐浴露、洗洁精等日用品的原料之一。目前已知的凉粉草有50多个品种，但主栽品种较单一，且产量不高、抗病性差，导致种质退化严重，因此亟需筛选出适合市场需求的优异、高产、抗病良种。

遗传多样性是生物学的核心之一，研究植物的遗传多样性，有助于对植物资源进行评价、选择、保存和利用，而表型农艺性状多样性是遗传多样性的具体表现，是遗传基础与环境多样性的综合体现。我国有着较为丰富的凉粉草种质资源，但近年研究主要关注凉粉草的有效成分、栽培、加工等方面。虽然对其也开展了一些有关遗传多样性的研究，但采用的多是传统的分子标记方法，例如：夏微采用SLAF-seq技术开发了凉粉草的SNP分子标记技术，并用其揭示了我国凉粉草种质资源的遗传背景：李晓晖采用SCoT和ISSR两种分子标记技术对7份凉粉草种质材料进行遗传多样性分析，发现其栽培种间有着明显的遗传差异，并将7份种质分为3大类群；张桂芳等对19个凉粉草样品进行RAPD指纹图谱的构建与遗传相似性研究，证明了种质间存在丰富的遗传多样性：陈菁瑛等采用ISSR分子标记技术对20份不同种源的仙草进行遗传多样性及亲缘关系分析，结果发现种源间的遗传差异与地理分布关系不密切而与形态差异有一定联系；Zhang等采用RAPD分子标记对来自于19个地区的凉粉草样品进行了聚类分析，结果显示，凉粉草种质间存在着丰富的遗传多样性，其地理分布与亲缘关系间有一定的相关性。虽然分子标记技术具有操作快速、能有效避免自然环境干扰的特点，但分析结果不能反映种质资源在产量、环境胁迫与适应性等方面的特征，而对种质资源的描述和评价仍然主要依靠农艺表型。但目前尚缺乏对凉粉草主要农艺表型遗传多样性的系统研究。因此，本研究以25份凉粉草种质资源为材料，对其12个农艺性状进行遗传多样性分析，并基于相关性分析、聚类分析和主成分分析对这25份种质材料进行综合评价，以期为筛选适种于广西龙州的凉粉草种质资源及拓宽其基因谱、选育新品种提供参考。

1材料与方法

1.1试验区概况

本试验于2021年2月在位于广西龙州县的广西南亚热带农业科学研究所基地进行。试验区地处东经106°33'～107°12'、北纬22°8'～22°44'之间，海拔200～1045m，坡度8°～15°。属明显的南亚热带季风气候，热量丰富，日照充足。年平均气温22.3～23.0℃，年极端高温为41.6℃，年极端低温为-3.0℃。日照时数1582.7h，无霜期达350d天以上。雨量充沛，年均降水量1174～1752mm，年蒸发量1569mm，雨热同期。

1.2试验材料

本试验所用凉粉草种质材料于2020年6-10月分别采集于越南及我国的台湾、广西、广东、福建和江西等省份（区），并保存在广西南亚热带农业科学研究所凉粉草种质资源圃（母本园）中，共25份，编号V1-V25，具体信息见表1。

1.3调查性状与试验方法

试验采取随机区组设计，小区面积5m2（1mx5m），每份材料种植3个小区，种植行距20cm、株距15cm，重复间留1m宽过道。观察并记录整个生育期每份种质的抗性情况，于成熟期（6月）每个小区随机选10株，数取分枝数，并从中选5片以上成熟叶片，用便携式SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素含量（SPAD值），用游标卡尺测叶厚，用钢卷尺测量叶长、叶宽、分枝长；收获时，每个小区随机取5株，调查单株产量并计算叶重率（除去杂物后，每100g干凉粉草中叶片和叶柄的质量总和）和水分含量。

每个小区随机取15株，在2月中旬（气温12℃）观察植株抗寒性，在4月中旬（生长盛期）观察植株病虫害情况，在6月（气温32℃以上）观察植株萎蔫情况，分别记录植株受害程度（≥75%、50%～75%、25%～50%、≤25%）。为了便于统计分析，对抗性性状（抗旱性、抗寒性、抗病虫害）进行等级划分并赋值：受害程度≥75%，抗性弱，赋值1；受害程度为50%～75%，抗性较弱，赋值2；受害程度为25%～50%，抗性较强，赋值3；受害程度≤25%，抗性强，赋值4。

1.4数据处理与统计分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行整理，采用SPSS26.0进行Pearson相关性分析及主成分分析，以各个主成分的特征值作为系数构建用于综合评价的函数式。基于欧式距离，采用Ward离差平方和法进行聚类分析。用CONA-C0 5画PCA图。用变异系数（CV）表示种质间性状值的离散特性，用Shannon-Wiener指数（H）进行遗传多样性分析评价。

参考唐鳳等的方法，对其他性状进行分级，共分为10级，划分标准见表2，计算每个性状的平均观测值（X）和标准差。根据X±Ko（K=0，1，2，3，4）计算每个性状每级的相对频率，最后计算H。计算公式如下：

2结果与分析

2.1凉粉草种质资源间农艺性状的变异分析及遗传多样性分析

由表3可知，凉粉草种质间各农艺性状均具有广泛的变异，变异系数在7.33%～50.90%之间，差异均达显著（P<0.05）或极显著水平（P<0.01）。其中，除了分枝数（7.75%）和叶厚（7.33%）的变异系数小于10.00%（弱变异）外，其他农艺性状的变异系数均大于10.00%，分枝长（50.90%）、单株产量（45.50%）、水分含量（35.22%）甚至超过30%（强变异），说明25份凉粉草种质材料间农艺性状的差异较明显。

由表4可知，各农艺性状的多样性指数H变化范围为1.219～2.111。其中，叶长的H'最高（2.111），在第1、4、7、9级中出现的频率均相同（为0.129），在第5、6级的出现频数最高；其次是分枝长（H为2.055），在第3、4、6级中出现的频率也相同（为0.202），在第7、9级的出现频数最高。说明这两个性状遗传基础较广，改良潜力最大。叶重率的多样性指数H'最低，即多样性低，变异性较小，是凉粉草种质中相对稳定的遗传性状。抗旱性、抗寒性、抗病虫害3个抗性性状分别在第2、3、2级的频数最高，说明凉粉草种质资源均具有较强的抗性。

2.2凉粉草种质资源农艺性状的相关分析

对25份凉粉草种质材料的12个农艺性状进行相关性分析，结果（表5）显示，单株产量与分枝数、分枝长、叶长、叶重率均呈极显著正相关关系（P<0.01），相关系数分别为0.607、0.790、0.674、0.766，说明茎叶增加与产量增加具有一致性。叶绿素相对含量与其他性状均呈负相关关系，除与叶长和单株产量的相关性达显著水平外，与其他性状的相关系数均较小，总体说明叶绿素对其他性状的影响不大。另外，分枝数与叶长、分枝长与叶重率呈极显著正相关（P<0.01），说明分枝与叶的发育具有一致性：抗寒性与抗旱性、抗病虫害均呈极显著正相关（P<0.01），说明这3个抗性的增强具有一致性；分枝长与抗寒性、抗病虫害呈显著正相关（P<0.05），说明植株抗性与凉粉草分枝特性也存在一定关系。

2.3凉粉草种质资源农艺性状的主成分分析

为了明确凉粉草农艺性状中起主导作用的因素，运用主成分分析法对多性状进行综合评判。由表6可知，从12个农艺性状中共提取到4个主成分（特征值大于1），贡献率分别为33.594%、19.319%、11.433%、10.735%，累积贡献率达75.081%．可反映凉粉草种质12个农艺性状的主要信息。其中，第一主成分（PCI）的特征值为4.031，载荷值较大的性状是单株产量、分枝长．叶重率，载荷值分别为0.927、0.877、0.854，反映的是分枝越长、叶重率越大，单株产量就越高，与相关分析结果一致；第二主成分（PC2）的特征值为2.318，载荷值的绝对值较大的性状是抗寒性、分枝数和叶长，载荷值分别为0.836、-0.718和-0.697，说明分枝数和叶长增大对植株抗寒性具有不良影响：第三主成分（PC3）的特征值为1.372，反映的是植株水分含量和抗旱性，载荷值分别为0.781和-0.709，说明植株水分含量越高越抗旱；第四主成分（PC4）的特征值为1.288，反映的是叶宽和叶厚，载荷值分别为0.659和0.597。4个主成分所反映的性状均不同，这些性状都是决定凉粉草种质特征及差异的重要农艺指标。

对前两个主成分进行分析（图1）发现，25份凉粉草种质材料在图中的分布没有明显规律，且分布范围较大，再次说明这些种质材料间确实存在广泛的遗传多样性。广西区域内外的凉粉草种质在图中的分布趋势存在一定的差异，但是没有出现明显的分离，说明不能简单依靠地域对种质进行划分，要充分考虑选取区域的范围大小及环境的影响，可通过选取多方面性状对特定环境和区域的凉粉草种质进行评价，以筛选特异种质。

2.4 25份凉粉草种质材料的综合评价

根据主成分分析结果，得到各主成分与12个农艺性状间的关系式：

然后用综合评价函数F=[入1／（入1+入2+入3+入4）]F1+[入2/（入1+入2+入3+入4）]F2+[入3/（入1+入2+入3+入4）]F3+[入4/（入1+入2+入3+入45）]F4（入1、入2、入3、入4分别为4个主成分对应的特征值）计算综合得分，结果见表7，综合得分越高，表示性状综合表现越优良。可见，25份凉粉草种质材料中排名前5的为V18、V16、V22、VIO、V11，尤其前3位的V18、V16和V22，综合得分明显高于其他种质，可作为选育凉粉草新品种的优良种质。

2.5凉粉草种质资源农艺性状的聚类分析

基于12个农艺性状对25份凉粉草种质进行聚类分析，在欧氏距离为10处可将其划分为3大类群（图2），各类群的性状见表8。其中，第1类包括V4-V23共20份种质，占所有种质的80入，该类群叶片最厚，单株产量适中（232.900g），抗性中等偏强，其余指标均居其他两个类群之间。第Ⅱ类包括V1、V2和V3共3份种质，该类群叶绿素相对含量最高，叶宽最大，抗旱性和抗寒性较弱或弱，弱抗病虫害，单株产量（109.667g）及其他性状最低。第Ⅲ类包括V24、V25共2份种质，该类群叶绿素相对含量和叶宽最低，叶厚居中，抗旱性较强，抗寒性中等偏强，抗病虫害较强或强，单株产量（401.500g）及其他性状均最高。三个类群总体表现为第Ⅲ类最好，第Ⅱ类最差，第1类居两者之间。

3讨论

凉粉草既是一种中草药，又是制作凉茶、凉粉的原料，市场需求量逐年增大。就广西而言，目前种植的凉粉草品种较单一，产量不高，没有自主选育的品种，国内已通过品种认定的适宜当地种植的品种也很少。因此，亟需选育优良的适栽品种。植物种质资源的遗传多样性是遗传改良及其相关研究的基础，可通过遗传多样性分析评价筛选出特异或优良的种质，以供育种生产及科研利用。虽然已有利用多种分子标记（SNP、RAPD、ISSR等）或基于表型性状对凉粉草遗传多样性进行研究的报道，但材料和性状较少。本研究选用25份来自多个产区的凉粉草种质材料，利用12个农艺性状，采用遗传多样性指数（H'）、变异系数（CV）及相关分析、主成分分析及聚类分析等对其进行遗传多样性分析。结果表明，各农艺性状种质间差异均达显著水平，变异系数在7.33%～50.90%之间，除分枝数和叶厚属于弱变异（CV<10%）外，其他性状均属于中、强变异（CV>10%），以分枝长的变异系数最大，说明该性状具有较高的遗传改良潜力。各农艺性状的H变化范围为1.219～2.111，其中叶长的H最高，叶重率的H最低，说明供试凉粉草种质间遗传多样性丰富，遗传基础广泛，这与夏薇采用SLAF-seq方法分析的凉粉草遗传多样性结果一致。另外发现，大部分凉粉草种质的再生能力和适应性较强，且具有较强的抗病虫性，这可能是因为凉粉草能挥发出一种特殊气味，以避免被采食。

相关分析结果表明凉粉草的这几个性状可作为凉粉草种质资源评价的主要指标。同时，通过主成分分析（PCA）对25份凉粉草种质材料进行综合评价，共提取到4个主成分，累积贡献率为75.081%。其中，第一主成分主要与单株产量、分枝长、叶重率有关，第二主成分主要与抗寒性、分枝数和叶长有关，第三主成分主要与植株水分和抗旱性有关，第四主成分主要与叶宽和叶厚有关。单株产量与分枝数、分枝长、叶长、叶重率呈极显著正相关，且载荷值较高，说明这些性状是引起凉粉草种质资源表型多样化的主要因素。经综合评价，V18、V16和V22三份种质综合表现较好，可考虑用作遗传育种的优异种質。

进一步的聚类分析可将25份凉粉草种质划分为3类：第1类共20份种质，包括上述3个综合表现好的种质，该类群各性状表现多处于中上水平，增产潜力较强。第Ⅱ类共3份种质，该类群各性状表现不佳，产量低，抗性弱，还需优化改良，不建议用于优良栽培品种选育。第Ⅲ类包含2份种质，该类群综合表现最好，单株产量最高，抗性强，适于用作选配优质、高产品种的杂交亲本。本研究还发现，种质聚类与产区分布并不一致，说明原始生境不是造成种质资源遗传多样性差异的唯一因素，各种质都经历了遗传分化但又存在频繁的基因交流，种质评价时需综合考虑多方面因素。

4结论

本试验选用的25份凉粉草种质遗传多样性较丰富，改良潜力较大，并筛选出V18、V16和V22三个综合评价较好的种质，可用作优良品种选育时的亲本。基于农艺性状对凉粉草遗传多样性进行评价的方法简单可行，然而，对表型性状的选择和观测鉴定易受栽培条件及生态环境等的影响，评价结果仍有一定局限性。今后可结合市场需求，对凉粉草品质方面的遗传多样性进行深入研究，以实现其药食同源保健功能育种开发的新目标。