从农艺性状及化学成分测定分析远志药材商品品规和良种选育的合理性

2016-11-19王丹丹白璐许晓双张福生邢婕贾金

中国中药杂志 2016年20期

王丹丹+白璐+许晓双+张福生+邢婕+贾金萍+田洪岭+秦雪梅

[摘要]通过对18份具有不同农艺性状特征的远志样品进行农艺性状（株高、根直径、根长、第一侧根分叉高度、侧根数、根重）分析，并采用HPLC对18份远志样品的3个指标性化学成分（细叶远志皂苷、远志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖）进行含量测定，最后通过散点图分析6个农艺性状与3个指标性化学成分的相关性。研究发现18份远志样品中的3个指标性化学成分含量与远志根直径均无明显相关性，且细叶远志皂苷含量与其余5个农艺性状也无明显相关性；远志酮Ⅲ在主根长较短、第一侧根分叉高度较短，侧根数较多的远志样品中含量较高；3，6′-二芥子酰基蔗糖在主根长较长的远志样品中含量较高。可见现行远志药材商品规格标准及等级划分与良种选育方法，并不符合优等药材其体内指标性化学成分含量较高的药典标准，所以急需制订出具有科学数据支撑的远志商品规格等级标准及良种选育方法。

[关键词]远志；农艺性状； HPLC；商品品规；良种选育

[Abstract]The agronomic traits （plant height， root diameter， root length， first lateral root height， lateral root amount， root weight） of 18 Polygala tenuifolia samples with different agronomic traits were analyzed， respectively. HPLC was used to analyze three main characteristic components including tenuifolin， polygalaxanthone Ⅲ， and 3，6′-disinapoyl sucrose. At last， the correlation between six agronomic traits and three main characteristic components were analyzed by scatter plot. We found no significant correlation between root diameter and three main characteristic components. There were no obvious correlations between tenuifolin and the remaining five agronomic traits. Short root length and first lateral root height as well as high lateral root amount resulted in high levels of polygalaxanthone Ⅲ in P. tenuifolia samples. High levels of 3，6′-disinapoyl sucrose were observed in P. tenuifolia samples with longer root. So， the current commodity criteria and traditional breeding of P. tenuifolia did not conform to pharmacopoeia standards， which excellent medicinal materials should have high contents of the main characteristic components. It was urgent to revise the current commodity criteria and breeding methods.

[Key words]Polygala tenuifolia； agronomic traits； HPLC； commodity criteria； breeding

doi：10.4268/cjcmm20162006

远志是我国常用的传统大宗中药材之一，始载于《神农本草经》，列为上品^[1]。2015年版《中国药典》中收载的远志，为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P. sibirica L.的干燥根，具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿等功效^[2]；其主要有效成分为皂苷类、酮类和糖酯类等化合物^[3]。关于商品远志的品质，传统“商品远志以筒粗、肉厚、去净木心之远志筒为佳”^[4]。现行的远志药材商品规格依然遵循1984年国家颁布的《七十六种药材商品规格标准》^[5]，将远志药材划分为志筒、志肉2种规格，其中志筒依据长度和中部直径的大小，划分为一等、二等2种等级，志肉只有统货1种等级。而2015年版《中国药典》则以细叶远志皂苷（≥2.0%）、远志酮Ⅲ（≥0.15%）、3，6′-二芥子酰基蔗糖（≥0.50%）含量的高低，作为评价商品远志质量优劣的标准^[2]。因此，远志药材的传统商品规格及等级是否与上述3个指标性化学成分的含量有必然的相关性，这一问题值得商榷。

目前，根类中药材新品种的传统选育方法主要参考根及根茎类农作物，以药材亩产量及根的农艺性状等作为主要选育指标。由于无商品化的种子来源，远志药材的生产种植目前仍处于一个粗放式、自采自种的原始阶段^[6]。长此以往，势必会导致远志品种的退化。因此，有必要且急需对远志药材进行良种选育。又因中药材的质量优劣与其药效的强弱密切相关，其药效的强弱又与其体内有效化学成分含量的高低密切相关^[7]。而作为远志药材传统良种选育的主要指标，根的农艺性状是否与上述3个指标性化学成分含量有必然的相关性，这一问题同样值得进一步商榷。

本文分别对18份具有不同农艺性状特征的远志样品进行农艺性状（株高、根直径、根长、第一侧根分叉高度、侧根数、根重）分析，并采用HPLC对远志的细叶远志皂苷、远志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖进行含量测定，最后通过散点图分析6个不同农艺性状与3个指标性化学成分间的相关性，进而探讨远志药材传统商品规格等级划分及良种选育方法的合理性。

1 材料

1.1 植物

本实验依托于山西省农科院经济作物研究所（以下简称经作所）。经作所先后从山西省内、外征集17份远志资源，并分别种植于经作所试验田。之后将征集到的所有远志种质资源利用系统选育法，从中选育出18个具有不同农艺性状的优良株系，并编号便于管理。本文所用18份远志样品均于2010年7月在远志新品种选育资源保存圃播种，依据大田管理细则进行统一管理，并于2013年11月采挖全植株（包括地上部分和地下部分），放置于阴凉通风处干燥。样品经秦雪梅教授鉴定为远志P. tenuifolia，凭证标本均保存于山西大学中医药现代研究中心。具体样品信息见表1。

1.2 仪器及试剂

Waters 高效液相色谱仪：高压泵（Waters 1525，美国）；紫外检测器（Waters 2487，美国）；Breeze 色谱工作站；色谱柱：agela-Venusil XBP C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm，中国）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

细叶远志皂苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号 MUST-140428801，纯度≥98%）；远志酮Ⅲ对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号 MUST-14100905，纯度≥98%）；3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号 111848-201303，纯度以96%计）。

2 方法

2.1 农艺性状的测定

按顺序从18个保存圃中随机选取6～10株远志样品进行采挖，采挖植株的同时，测量并记录以下4个农艺性状：株高（cm）、根长（cm）、第一侧根分叉高度（cm，芦头到第1个侧根的长度）、侧根数（个）；待根干燥后，测量并记录以下2个农艺性状：根直径（cm，由于远志药材的根长在20 cm左右，且根顶部的直径与底部的直径没有太大的差异，所以将芦头下3 cm处主根的直径认为是根的直径）及根重（g）。

2.2 指标性化学成分的含量测定

细叶远志皂苷、远志酮Ⅲ和3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量测定方法均参照2015年版《中国药典》一部中远志的含量测定项下的高效液相色谱法进行测定^[2]。

2.2.1 细叶远志皂苷的含量测定对照品溶液及供试品溶液的制备方法参照2015年版《中国药典》。

色谱条件：以甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）为流动相；检测波长 210 nm；流速1.0 mL·min^-1；运行时间30 min。每个测试样品均平行备样2份，并且每份样品平行进样2针，每次进样10 μL。

2.2.2 远志酮Ⅲ和3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量测定对照品溶液及供试品溶液的制备方法参照2015年版《中国药典》。

色谱条件：以乙腈-0.05%磷酸溶液（18∶82）为流动相；检测波长为320 nm；流速1.0 mL·min^-1，运行时间40 min。每个测试样品均平行备样2份，并且每份样品平行进样2针，每次进样10 μL。

2.3 数据处理

各项农艺性状均以±s表示，3个指标性化学成分含量以表示，并基于SPSS 16.0（IBM SPSS，USA）软件，分别依据18份远志样品的农艺性状和3个指标性化学成分含量进行聚类分析，并分别对农艺性状和3个指标性化学成分含量进行相关性分析。最后，采用OriginPro 8软件（originlab，USA）对6个农艺性状与3个指标性成分的含量做散点图^[8]，分析农艺性状和指标性成分之间的相关性。

3 结果与分析

3.1 远志农艺性状分析

3.1.1 6个农艺性状的测定结果与分析 18份远志样品的农艺性状均存在显著性差异，见表2。结果表明：①株高的变化范围为18.23～31.71 cm，平均22.96 cm；其中4号样品的平均株高最高，为31.71 cm；15号样品的平均株高最低，为18.23 cm。②根直径的变化范围为0.29～0.50 cm，平均0.42 cm；其中13号样品的平均直径最大，为0.50 cm；1号样品的平均直径最小，为0.29 cm。③根长的变化范围为15.93～21.65 cm，平均19.06 cm；其中6号样品的平均根长最长，为21.65 cm；8号样品的平均根长最短，为15.93 cm。④第一侧根分叉高度的变化范围为3.92～10.19 cm，平均6.33 cm；其中5号样品的平均根分叉高度最长，为10.19 cm；18号样品的平均根分叉高度最短，为3.92 cm。⑤侧根数的变化范围为2.09～7.82个，平均4.25个；其中14号样品的平均侧根数最多，为7.82个；1号样品的平均侧根数最少，为2.09个。⑥根重的变化范围为1.20～4.58 g，平均2.82 g；其中13号样品的平均单株根重最大，为4.58 g；1号样品的平均单株根重，为1.20 g。

各项农艺性状指标的变异系数（coefficient of variance，CV，变异系数=均方差/平均值）^[9]从大到小，依次为侧根数>根重>第一侧根分叉高度>株高>根直径>根长。样品性状的变异系数越大，则遗传多样性越大，良种选育时选择潜力越大^[10]。其中，侧根数的变异系数（0.384）最大，可选择的范围也最宽，选择效果最好^[11]；而根长的变异系数（0.078）最小，可选择的范围最窄。第一侧根分叉高度与远志抽心的难易程度密切相关，其变异系数为0.254，说明可选择的空间较大；而根重与远志的产量密切相关，其变异系数为0.299，可见也有一定的选择空间。综上可知，18份远志样品的6个不同农艺性状均存在着不同的变异幅度。

3.1.2 18份远志药材样品的农艺性状特征聚类分析在目前的实际应用中，系统聚类法（hierarchical clustering methods，也称层次聚类法）和K均值聚类法（K-means）是聚类分析中最常用的2种方法。系统聚类法由于类与类之间的距离计算方法灵活多样，使其可以适应不同的要求，该方法是目前实践中使用最多的，其中离差平方和法（Ward′s method）分类效果较好，应用比较广泛。需要注意的是，采用离差平方和法，样本间的距离必须采用欧氏距离（Euclidean distance）^[12]。

因此本文采用SPSS 16.0软件中的离差平方和法对18份远志样品的农艺性状数据进行聚类分析，见图1。18份样品明显分为3组，其中第一组包括6个远志样品（3，12，8，6，17，13），它们的株高中等，根直径和根重最高；侧根数较多，第一侧根分叉高度较短，属于产量较高，但比较难抽心的类型。第二组也包括6个远志样品（10，15，7，16，1，5），它们的株高，根直径和根重最低；侧根数较少，第一侧根分叉高度较长，属于产量较低，但比较容易抽心的类型。第三组也包括6个远志样品（2，11，9，14，16，4），它们的株高最高，根直径和根重中等；侧根数和第一侧根分叉高度也处于中等水平，属于产量中等，抽心难易程度也处于中等水平的类型。每组中根长比较稳定，所以可推测18份远志样品并不是依据根长来进行分组的。

3.1.3 不同农艺性状特征间的相关性分析相关性分析目前应用最广的为Pearson相关和Spearman秩相关，其中Pearson相关要求原数据服从正态分布，而Spearman秩相关属于非参数检验，并不知道物种服从何种分布，用起来更为灵活方便^[13]。

经过检验，侧根数和根重不符合正态分布，所以采用Spearman秩相关对各农艺性状进行相关性分析，见表3。结果表明：①株高与根直径、侧根数、根重呈极显著（P<0.001）正相关；②根直径与侧根数、根重呈极显著正相关，与第一侧根分叉高度呈极显著负相关；③根长与根重呈极显著正相关；④第一侧根分叉高度与侧根数呈极显著负相关；⑤侧根数与根重呈极显著正相关。

可见远志药材根直径越粗、根长越长、根重越重，则远志药材的产量越高，而远志药材的侧根数越多，第一侧根分叉高度越短，则越不利于远志药材的抽心处理。可根据各农艺性状间的相关性，对某一性状进行间接选择，并且可取得良好的选择效果^[10]。

3.2 远志指标性化学成分分析

3.2.1 3个指标性化学成分含量测定结果与分析在本实验的色谱条件下，远志样品中的细叶远志皂苷、远志酮Ⅲ和3，6′-二芥子酰基蔗糖峰分离度均大于1.5，可完全分离，峰型窄而且对称。分别测定18份远志样品的3个指标性化学成分的含量，结果见表4。

结果表明，所有18份远志样品，①细叶远志皂苷平均含量为3.04%，其中含量最高的为15号样品，质量分数为4.07%；含量最低的为12号样品，质量分数为1.80%。除12号远志样品外，均符合药典标准（≥2.0%）。②远志酮Ⅲ的平均质量分数为0.20%，其中含量最高的为8号样品，质量分数为0.46%；含量最低的为5号样品，质量分数为0.08%。其中2，5，6，10，11，16，18号远志样品的远志酮Ⅲ含量均不符合药典标准（≥0.15%）。③3，6′-二芥子酰基蔗糖的平均质量分数为0.72%，其中含量最高的为12号样品，质量分数为1.17%；16号样品含量最低，质量分数为0.47%，次之为2号样品，其质量分数为0.48%。除2号、16号远志样品外，其余样品均符合药典标准（≥0.50%）。由表4可见，同一成分在18份远志样品中的含量明显不同，且不同成分的波动范围也明显不同。其中细叶远志皂苷的变异系数最小，为0.155，说明细叶远志皂苷的含量与样品的直径无关；3，6′-二芥子酰基蔗糖的变异系数居中，为0.239；而远志酮Ⅲ的变异系数最大，为0.473，并且18份远志样品中有7份样品不符合药典规定，说明远志药材中远志酮Ⅲ的含量可能比细叶远志皂苷的含量更容易随外界因素发生变化。因此，推测药典中规定的远志酮Ⅲ的质控下限值可能有些偏高，可适当降低含量标准，且以远志酮Ⅲ为指标性成分用于远志药材商品规格等级的划分值得商榷。

3.2.2 18份远志药材样品的指标性成分聚类分析本文采用SPSS 16.0软件中的离差平方和法对18份远志样品的农艺性状数据进行聚类分析，见图2。18份样品明显分为2组，其中第一组包括15个远志样品（6，10，11，9，18，5，1，13，14，2，16，4，7，8，15），它们的细叶远志皂苷含量较高，远志酮Ⅲ含量较低，3，6′-二芥子酰基蔗糖含量较低。第二组包括3个远志样品（3，17，12），它们的细叶远志皂苷含量较低，远志酮Ⅲ含量较高，3，6′-二芥子酰基蔗糖含量较高。

3.2.3 不同指标性成分含量间的相关性分析经过检验，各指标性成分含量符合正态分布，用Pearson相关对各指标性成分含量间进行相关性分析，见表5。结果表明：①细叶远志皂苷含量与远志酮Ⅲ含量之间呈现显著负相关（P<0.05）；②3，6′-二芥子酰基蔗糖含量与细叶远志皂苷含量和远志酮Ⅲ含量分别呈负相关，但无统计学意义。由此推测：细叶远志皂苷的含量越高，则远志酮Ⅲ的含量越低，这与远志药材样品的指标性成分聚类结果一致。

3.3 3个指标性化学成分含量与不同农艺性状特征间的相关性分析

本研究对6个农艺性状与3个指标性成分的含量分别做散点图，见图3。结果表明：①细叶远志皂苷的含量在6个不同农艺性状中的含量变化范围较大，无明显的变化规律；②远志酮Ⅲ的含量与根长（图3C）、第一侧根分叉高度（图3D）呈负相关（图中代表远志酮Ⅲ含量的点从左至右分布在一条斜率向下的直线上），与侧根数（图3E）呈正相关（图中代表远志酮Ⅲ含量的点从左至右分布在一条斜率向上的直线上），与其他农艺性状无明显的变化规律；③3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量与根长（图3C）呈正相关（直线斜率向上），与其他农艺性状无明显的变化规律。

以上结果提示：细叶远志皂苷的含量高低与6个农艺性状无明显相关性；远志酮Ⅲ在根较短，第一侧根分叉高度较短，侧根数较多的样品中含量较高；3，6′-二芥子酰基蔗糖在根较长的样品中含量较高。

18份样品依据农艺性状得到的聚类分组（图1）和依据指标性化学成分含量得到的聚类分组（图2）并不完全相同，这可能是由于同一物质的不同属性造成不同的分组结果。图1中根直径最高的一组（3，17，12，8，6，13），依据3个指标性成分含量进行分组，被分到了不同的2组中，说明3个指标性化学成分的含量与根直径无关；并且3号、17号和12号在2个聚类图中都被分到了同一组，这3份样品具有侧根数较多，第一侧根分叉高度较短的农艺性状，且远志酮Ⅲ的含量较高，这与图3得到的结果一致。由于3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量与根长有关，但是农艺性状的聚类分组并不是依据根长进行的，所以图3的结果是对图1和图2结果的补充，得到3，6′-二芥子酰基蔗糖在根较长的样品中含量较高的结论。

4 讨论

本文研究结果表明，18份远志样品中的3个指标性化学成分含量与远志根直径均无明显相关性，因此本文认为，现行的依据是否抽心以及根的粗细等来划分远志药材的商品规格与等级，并依据远志药材的亩产量及根的农艺性状等作为远志良种选育主要指标，存在一定的片面性。

4.1 现有远志药材商品规格标准与等级划分的不足

自古以来，中药材作为一种特殊的商品，已形成“看货评级，分档议价”的经验判别方法^[14]，“辨状论质”在中药材商品规格等级方面始终起着理论指导作用^[15]。现行的远志商品规格标准依然遵循《七十六种药材商品规格标准》对远志药材商品规格和等级的划分标准^[5]。目前市场上出售的远志饮片大多是经过抽心处理的志筒或志肉，但目前关于远志是否抽心仍尚无明确定论^[16-17]。并且市场上流通的远志药材，已远远超出了志筒、志肉这2种规格，出现了志筒与远志根（或者志肉、芦头等）按不同比例掺杂的多种规格；不同规格又按抽心率的大小及远志筒（根）的粗细来划分远志药材的等级，且市场中没有明确的行业标准^[18]，导致市场中商品规格标准及等级划分比较混乱。

化学成分作为中药材发挥药效的物质基础，从理论上看，药材的规格等级与化学成分含量之间似乎应存在某种必然联系，但事实并非如此，如川芎（不同规格川芎4种化学成分含量均无显著性差异）^[19]、款冬花（优级款冬花样品中芦丁平均含量略高于统货样品，但二者差别不大）^[20]、白芍（指标性成分含有量最高的是传统规格的三等白芍）^[21]等药材的商品规格等级与化学成分含量之间没有明显的相关性。房敏峰等^[22]利用HPLC测定不同商品规格等级的远志样品中远志皂苷元的含量，发现一级筒中皂苷元含量低于二、三级筒。本课题组曾对不同规格远志药材中的3个指标性化学成分的含量进行测定^[23]，发现：①不同批次远志样品间细叶皂苷的含量差异较大，无明显规律，说明细叶远志皂苷含量与远志样品直径无关，与本文结论一致；②远志酮Ⅲ的含量在远志筒中含量变化范围较窄，在根中比较离散，说明远志酮Ⅲ的含量与远志样品直径无关，与本文结论一致；③除1号野生品外，3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量，在远志样品中变化范围较窄，说明3，6′-二芥子酰基蔗糖的含量与远志样品直径无关，与本文结论一致。上述结果与现行远志药材商品规格^[5]相矛盾。由此可见，现有远志药材的商品规格标准及等级划分，在市场定价及流通环节上无法起到应有的指导作用，而上述现象在不同药材品种中也有发生。有学者认为应将药材的化学成分与外观性状结合起来评价商品规格标准及等级划分的科学性及合理性^[24]，以及用生物活性来反映商品规格及等级的内涵^[25]。因此，本文建议先按照远志是否抽心将远志药材划分为远志筒与远志根2种规格，再分别按照形态、有效成分含量、生物活性等将不同规格的药材划分为不同的等级。

4.2 远志药材传统良种选育方法的不足

远志的良种选育是建立规范化、规模化种质的基础，能从根本上解决目前远志生产上存在的品种混乱、种质退化、产量下降、质量参差不齐、生产潜力不足等问题，使远志药材生产朝着优质、高产、质量稳定的方向发展，实现资源的可持续利用。目前远志的良种选育主要经历“引种—驯化—选种”等过程，且选育出一个新品种需要经历几年甚至十几年的时间。经作所历经16年（1996—2012年），对远志各生育期观察和通过抗性、产量性状等比较，选育出我国第一个远志品种——晋远1号^[26]。相对于农作物以产量优先兼顾品质，中药材则首先应以品质（整齐度、质量指标）为先，其次再考虑其产量、抗性等^[27]。因此，现阶段有必要制订更加系统的良种选育方法，加快远志良种选育的进程，如采用代谢组学技术、DNA分子标记技术等对远志良种进行质量评价和鉴定，同时应加强植物次生代谢产物生物合成的分子调控研究等^[28]。同时，本文研究结果表明，远志酮Ⅲ在主根长较短、第一侧根分叉高度较短，侧根数较多的远志样品中含量较高；3，6′-二芥子酰基蔗糖在主根长较长的远志样品中含量较高，这为今后远志的良种定向选育（以目标活性物质含量的高低为依据）提供了依据。

综上所述，中药材“辨状论质”是几千年中医药传统经验的总结，既有合理内涵，也存在一定的局限性。因此在制订远志药材商品规格标准及等级划分和筛选优良种质资源时，不仅要继承传统经验方法，还应综合考虑药材中有效成分含量及生物活性等；此外，在进行远志药材的良种选育时，可根据选育用途来确定目标性状，在药效优先的情况下，兼顾产量，最终使研究成果能遵循科学、合理、实用性的原则。

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