口腔鳞状细胞癌中酪氨酸激酶受体-2的表达与临床病理特征的关系

沈 阳,费 伟,骆 敬

(1.成都市第七人民医院口腔科,四川 成都 610044;2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科,四川 成都 610072)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的发生和发展需要多种信号通路共同参与[1]。酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase receptor-2,Tie-2)是一种酪氨酸激酶受体,对促进肿瘤淋巴管和血管形成具有至关重要的作用[2,3]。大量研究证实,Tie-2在其他恶性肿瘤中表达上调会刺激癌细胞增殖,促进肿瘤发生局部和远处转移,而且Tie-2阳性率与肿瘤恶性程度之间存在极其密切的联系[4,5]。然而关于Tie-2受体在OSCC中的表达情况,以及Tie-2阳性率是否与OSCC临床病理相关鲜有报道。本研究采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 检测Tie-2在OSCC中的表达情况,并分析其与临床病理参数的关系,为寻找OSCC治疗的潜在靶点提供新依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2019年12月至2021年6月在四川省人民医院颌面外科就诊的110例OSCC患者,纳入标准:① 均经病理学确诊;②临床病历资料保存完整;③患者及家属知情同意。排除标准:①术前行放化疗等抗肿瘤治疗;②手术仅行原发灶切除而未进行颈淋巴结清扫;③合并有其他系统恶性肿瘤、免疫系统疾病、血液系统疾病等。其中男60例,女50例,年龄(54.0±2.1)岁。根据世界卫生组织(WHO)提出肿瘤组织病理分级标准[6],术后病理诊断为高分化42例、中分化38例、低分化30例。其中30例患者存在颌骨侵犯,37例患者存在颈淋巴结转移。另选同期30例非肿瘤患者正常口腔黏膜组织作为对照组,其中男16例,女 14例,年龄(52.2±4.2)岁。两组性别和年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得四川省人民医院伦理委员会的批准。

1.2 IHC检测免疫组化染色过程按试剂盒所附说明进行,石蜡标本4 μm连续切片,常规脱蜡、抗原修复;加入兔抗人Tie-2单克隆抗体(亲科生物研究中心有限公司;1∶200),孵育1 h;加入二抗,孵育20 min;加入DAB 溶液显色,蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片,电子显微镜下观察采图。

1.3 判定Tie-2表达由专业病理人员采用双盲法判定Tie-2的阳性表达[7]:把每一张经过染色后的玻片放在200倍镜下观察,每例标本随机选取5个视野(×200)计算阳性细胞所占肿瘤细胞数的百分比,从而得到着色细胞百分比。同时观察组织着色程度,将两者相乘所得结果进行评分,分数为0～2分表示Tie-2阴性表达,分数≥3分表示Tie-2阳性表达。见表1。对存在颌骨侵犯的标本,用Image J 1.8.0图像解析软件对骨病变周围肿瘤组织以及其他部位肿瘤(距离骨病变周围肿瘤组织边缘>3 cm)检测,计算平均光密度值(mean optical density,MOD)来反映染色强度。

表1 TIE-2表达评分标准

1.4 统计学方法利用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析,使用 Graph Pad Prism 5.0 软件绘制统计图。计数资料组间比较采用卡方检验;计量资料数据采用均数±标准差表示,比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tie-2在OSCC组织与正常组织中的阳性表达率比较免疫组织化学检测显示,OSCC组织中Tie-2表达阳性率高达78.2%(86/110);正常口腔组织样本中Tie-2表达阳性率为20%(6/30),Tie-2在OSCC组织中阳性表达率显著高于正常口腔组织,差异有统计学意义(χ2=4.634,P<0.05)。

2.2 Tie-2在OSCC组织中的主要分布情况在癌细胞胞浆中可见Tie-2阳性表达(图1a),在癌组织血管内皮细胞中也呈阳性表达(图2a)。此外,在癌巢内发现大量Tie-2阳性表达的单核细胞聚集(Tie-2 expressing monocytes,TEM)(图2b)。

图1 肿瘤组织和正常组织中Tie-2的表达情况 a:肿瘤组织;b:正常组织(IHC,×100)

图2 Tie-2在肿瘤组织中的表达 a:Tie-2在血管内皮细胞中的阳性表达;b:癌巢中可见大量TEM (IHC,×200)

2.3 不同部位肿瘤组织Tie-2的表达情况骨病变周围肿瘤组织Tie-2的阳性表达率明显高于其它部位肿瘤组织,组织染色程度显著加深。骨旁肿瘤组织MOD值(0.42±0.13)显著高于其它部位肿瘤组织(0.23±0.12),差异有统计学意义(χ2=2.640,P<0.05)。见图3。

2.4 不同临床特征中Tie-2的表达水平比较低分化组Tie-2阳性表达例数高于中分化及高分化组,中分化组Tie-2阳性表达例数高于高分化组,肿瘤组织分化程度低者,Tie-2的阳性表达率更高(P<0.05)。相较于不存在淋巴结转移的OSCC病例,存在淋巴结转移的OSCC中Tie-2阳性表达率显著增加(P<0.05)。此外,在有颌骨侵犯的所有30例患者肿瘤组织中,均存在Tie-2阳性表达,其阳性表达率显著高于无颌骨侵犯组(P<0.001)。见表2。

3 讨论

Tie-2最初被认为是一种特殊的血管生长因子,能在不同生理环境下对血管内皮细胞功能进行调控[8]。但近年来已有许多研究提示其在非血管正常组织和病理组织中表达,如造血干细胞、成骨细胞、TEM和多种癌细胞[5,9～11]。有研究报道称:Tie-2过表达会刺激肿瘤淋巴管和血管生成,加速肿瘤生长和转移[2,3]。最近研究表明,Tie-2高表达不仅局限于血管结构中,在各种癌症的非血管细胞中也有表达,如胃癌、乳腺癌和胶质瘤等[8]。研究发现,Tie-2在乳腺癌肿瘤组织中的表达较正常组织明显升高[4]。但目前对于Tie-2在OSCC组织中表达情况的研究十分匮乏。本研究中,我们通过IHC检测Tie-2在OSCC组织与正常口腔组织中的表达差异,我们发现Tie-2在OSCC组肿瘤组织中明显表达增多,这也可以对既往的研究结果进行进一步补充。

活化的血管内皮细胞会分泌血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2),将TEM募集到肿瘤组织内[11,12]。TEM是肿瘤相关巨噬细胞的一个亚种,也是循环系统中Tie-2阳性免疫细胞的主要群种[13,14]。Joseph等在非小细胞肺癌中发现TEM的聚集,并证实了TEM能够和Ang-2产生协同作用促进癌细胞增殖,刺激肿瘤组织血管形成[15]。有研究报道称:选择性消除TEM会损害血管生成并抑制肿瘤生长[12,14]。由于TEM在肿瘤中的特殊性,已有学者建议将TEM用作一种新的诊断标志物并使其成为有希望的治疗靶点之一[16]。在本研究中,我们可以在病理下发现OSCC的癌巢内可见大量TEM,因此推测TEM的大量聚集参与了OSCC 的发生发展过程。

OSCC在所有OCC中最常见,占OCC的90%以上[17]。OSCC作为一种来源于上皮的肿瘤,对其周围组织的侵犯十分明显。尽管外科手术和放化疗技术不断进步,但OSCC患者5年生存率并无显著改善,仍约为50.0%[18,19]。在OSCC局部侵犯行为中,侵犯颌骨并造成骨质破坏的现象时有发生。只要OSCC侵犯骨皮质,则将其划分为T4期[1]。若骨髓质被侵袭,则提示患者可能会出现较差的预后及较高的致死率[20]。据研究表明,Ang-2常作为Tie-2的配体,Ang/Tie-2信号体系在调节骨代谢方面有着十分重要的作用[21,22]。最近许多研究发现,Ang-2可作为一种环境依赖性激动剂,在病理状态下,尤其是在癌症微环境中,Ang-2可作为Tie-2的激动剂促进肿瘤侵袭和肿瘤血管生成,并导致多重耐药发生[23,24]。转基因鼠中Ang-1过度表达能够增加其骨量,此外,Ang/Tie-2信号体系也被证实在乳腺癌骨转移过程中起到了十分重要的作用[5,25]。Tang等在骨转移性前列腺癌细胞系中找到了Tie-2阳性细胞群,这些细胞与Tie-2阴性细胞群相比,不仅表现出更强的骨黏附能力,且对化疗药物有更强的抗性[12]。本研究发现在骨旁肿瘤组织中的表达率明显高于其他部位的肿瘤组织,骨旁肿瘤组织着色的程度更深、Tie-2表达的量更高,所有出现颌骨侵犯的患者肿瘤组织中,均存在Tie-2阳性表达。因此,可以推测Tie-2可能也在OSCC侵犯颌骨的病理生理过程中产生着巨大的作用。

此外,本研究还探讨了Tie-2在肿瘤组织中的表达情况与OSCC病理分级之间的关系,发现表达Tie-2高表达与OSCC的恶性生物学行为有关。Tie-2在低分化OSCC的表达率明显高于中分化、高分化的OSCC。高表达的Tie-2与淋巴结转移密切相关。相对于没有发生淋巴结转移的OSCC,已经出现淋巴结转移的OSCC中的Tie-2的阳性表达率更高。

综上所述,本研究发现Tie-2在OSCC中存在高表达现象,Tie-2在不同OSCC病理分级、是否存在淋巴结转移及颌骨侵犯中存在差异性表达。这也提示Tie-2有望成为OSCC的治疗靶点,具体作用机制有待深入研究。但本研究样本量较小,需要进一步扩大样本量来进行研究。此外,本研究没有对患者的TNM分期、生存预后进行分析,在今后的研究中可进一步探讨Tie-2的表达对患者预后的影响。同时,更高级的检查技术如:实时-PCR、蛋白质印迹法应当用于之后的研究中,以利于进一步探讨Tie-2对OSCC发生发展的潜在机制。