血清可溶性CD276与晚期高级别浆液性卵巢癌预后及肿瘤免疫浸润相关性分析

蒋 艳,黎雪梅,邹吴春,任 丽,何 春,阳袁莉

(1.四川大学华西医院资阳医院/资阳市第一人民医院妇科,四川 资阳 641300;2.成都市妇女儿童中心医院妇产科,四川 成都 610000)

以卵巢癌为代表的妇科疾病被称为是导致女性死亡的妇科肿瘤三大杀手之一,在发展中国家属于最常见的妇科恶性肿瘤[1]。高级别浆液性卵巢癌(advanced high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是上皮性卵巢癌的常见亚型之一,因其具有典型的组织学和分子学异质性,检测手段缺乏特异性,患者因感不适就诊时多已至中晚期[2]。目前卵巢癌的发病率控制方面的进展甚微,且越来越呈年轻化趋势。最近有学者指出,肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TILs)通过某些途径参与肿瘤的发生、发展,如从血管渗出进入实体瘤微环境的CD8+细胞,其水平表达与结直肠癌的微血管密度密切相关,联合靶向治疗促进CD8+细胞水平能达到抗血管生成的目的[3];作为B7家族的跨膜蛋白B7-H3(CD276),其在肿瘤微环境的调节中起着复杂作用,能直接作用于靶细胞作为免疫检查点,同时还可能参与癌细胞的胞内信息传递,为众多肿瘤的潜在治疗靶点提供了可能性[4]。但目前关于血清CD276与HGSOC临床结局的关系尚存在争议。本研究收集73例晚期HGSOC患者的临床资料,旨在分析血清可溶性CD276(sCD276)对晚期HGSOC患者免疫环境的影响及与预后的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入标准:①临床资料完整,所有受试者均能配合随访;②术前为进行放疗、靶向、免疫和化疗等治疗;③HGSOC均为原发性病变,病理分期为IIIc期及IV期。排除标准:①有血液系统疾病和自身免疫性疾病;②合并重大脏器损伤等影响实验结果的并发症;③存在其他恶性肿瘤和全身感染者;④存在认知功能障碍和精神疾病者;⑤卵巢癌复发者;剔除标准:①未能定期随访者;②随访时间不足者;③实验室检查结果不完整的受试者。将2017 年3 月至2020 年3 月于资阳市第一人民医院就诊的晚期HGSOC患者73 例纳入A组,年龄42～78 岁[(62.75±6.24)岁];根据国际妇产科联盟临床分期[5]分为IIIc期42例、IV期31例;有淋巴结转移57 例,无淋巴结转移16 例。选取同期入院治疗的其他类型卵巢癌患者80 例纳入B组,年龄41～76 岁[(62.24±7.27)岁],根据疾病类型分为子宫内膜样癌32 例,黏液性癌24 例,透明细胞癌17 例,低级别浆液性癌7 例;临床分期分为IIIc期48 例、IV期32 例;根据有无淋巴结转移可分为:有淋巴结转移60 例,无淋巴结转移20 例。另选择80 名健康人群作为健康人群组,年龄43 岁～72 岁[(62.53±6.58)岁]。三组受试者的年龄、临床分期、淋巴结转移情况比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得医学伦理委员会同意批准,受试者同意接受治疗并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1血清指标的检测 三组受试者均于清晨空腹采集外周静脉血3 ml,进行离心处理(3000 r/min,10min),凝固分离得到血清,采用酶联免疫吸附法检测血清sCD276的表达水平。

1.2.2组织标本获取及检测 收集所选晚期HGSOC患者术后癌中间组织、距肿瘤边缘约5 cm癌旁组织制作成标本,采用免疫组化法进行检测,将标本置于10%甲醛溶液中固定,后经石蜡包埋处理后制成5 μm的切片标本,检测细胞表面CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和调节性叉头状转录因子P3(regulatory forkhead transcription factor P3,FoxP3+)的表达。将其编码并在70 ℃烤箱中烘干,后加入二甲苯液脱蜡、95%乙醇浸泡水化处理、高温高压抗原修复等一系列操作后,加入鼠抗人单克隆抗体作为一抗,按照试剂盒合适比例稀释,保证一抗溶液能完全覆盖切片标本,再37 ℃孵育1 h,使用磷酸缓冲溶液清洗后甩干玻片,于组织中央加入二抗,在25 ℃下孵育1 h,使用磷酸缓冲溶液清洗后滴加现配的二氨基联苯胺染色液,再清水冲洗二氨基联苯胺染色液后将玻片置于苏木素染液中浸润复染,最后切片梯度酒精脱水(浓度依次为75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇),脱水后置于二甲苯中透明处理,中性树胶封片,盖玻片覆盖晾干处理。使用光学显微镜高倍视野下观察切片,磷酸缓冲溶液代替一抗作为空白对照。阳性结果染色强度由弱至强评分:0 分(无着色)、1 分(浅黄色)、2 分(棕黄色)、3 分(棕褐色)。阳性细胞比例评分:0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2 分(26%～50%)、3 分(51%～75%)、4分(76%～100%)。将染色强度评分×阳性细胞比例评分的总分作为最终分值[6]:0 分为阴性(-),1～5 分为弱阳性(+),6～9 分为中度阳性(++),10～12 分为强阳性(+++),综合评价最终分值<5分为CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+和FoxP3+阴性,最终分值≥5分为CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+、CD276+和FoxP3+阳性。CD276以肿瘤细胞膜免疫反应阳性为标志。

1.3 随访指标通过门诊、电话或住院方式对肿瘤患者第1 年至少每3 个月随访1 次,第2～3年至少每6 个月随访1 次,持续随访3 年,随访终点以患者死亡或失访为终点事件。其中总生存率定义为初始诊断癌症时间至死亡或失访时间,无进展生存期定义为癌症初始诊断至首次复发或死亡或失访时间,无病生存率定义为患者肿瘤切除结束至局部复发或死亡或失访时间。

1.4 统计学方法应用SPSS 26.0统计学软件分析数据。计量资料用均数±标准差描述,比较采用t检验;计数资料用例数(%)表示,比较采用χ2检验;采用Kaplan-Meier描绘生存曲线,Cox比例风险回归进行预后多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清sCD276表达水平的比较A组和B组血清sCD276表达水平分别为(496.24±78.85) pg/ml、(403.66±70.47) pg/ml,均高于健康人群组(242.07±25.56) pg/ml(P<0.05),且A组血清sCD276表达水平高于B组(P<0.05)。

2.2 血清sCD276表达水平在卵巢癌患者中的预后表达情况比较将A、B两组卵巢癌患者依据血清sCD276表达水平中位数进行分组,分为高表达组(≥451.26 pg/ml)和低表达组(<451.26 pg/ml)。A组中低表达组患者的无病生存率及总生存率均高于高表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。A组中无病生存时间≥12个月的患者血清sCD276表达水平(214.58±74.10) pg/ml,低于无病生存时间<12个月组(316.61±85.27) pg/ml,差异有统计学意义(t=4.96,P<0.05)。

表1 A组不同血清sCD276表达水平患者的无病生存率、总生存率比较 (%)

2.3 A组不同血清sCD276表达水平患者的临床特征比较A组患者依据血清sCD276表达水平分为sCD276≥451.26 pg/ml组和sCD276<451.26 pg/ml组。两组患者在年龄、有无绝经、临床分期、CA125水平、BRCA基因突变、有无新辅助化疗、有无CD4+、CD8+、CD80+、CD86+阳性等方面比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组在有无淋巴结转移、有无术后残余病灶、有无CD3+阳性、FoxP3+阳性等方面比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 A组不同血清sCD276表达水平患者的临床特征比较[n(%)]

2.4 影响晚期HGSOC患者预后的多因素Cox回归分析将HGSOC患者预后作为因变量,以有淋巴结转移、有术后残余病灶、CD3+阳性、FoxP3+阳性、血清sCD276≥451.26 pg/ml作为自变量,经多因素COX风险回归分析得出,有术后残余病灶、CD3+阳性、FoxP3+阳性、血清sCD276≥451.26 pg/ml均是晚期HGSOC患者预后的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响晚期HGSOC患者预后的多因素Cox回归分析

2.5 肿瘤组织膜CD276不同表达亚组患者中血清sCD276及TILs的表达情况经免疫组化法对肿瘤组织检测得出,A组中有59例患者膜CD276表达为阳性,14例患者膜CD276表达为阴性。膜CD276阳性组的血清sCD276表达及FoxP3+阳性比例均明显高于膜CD276阴性组(P<0.05),两组CD3+阳性、CD4+阳性、CD8+阳性、CD80+阳性、CD86+阳性比例等指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 肿瘤组织膜CD276不同表达亚组患者中血清sCD276及TILs的表达情况比较

3 讨论

卵巢癌在中国女性常见癌症中排名第三位,5年生存率为30%～40%[7]。近几年,临床学术界迎来了免疫逃逸学热潮,主要是研究人体免疫系统和恶性肿瘤关联的恶性生物学行为[8]。CD276是一种I型跨膜蛋白,基于蛋白序列的相似性,被认为是B7家族的免疫检查点成员,在肿瘤领域获得了广泛关注[9]。迄今为止,有多数研究阐述称,CD276的促肿瘤功能与肿瘤生长、葡萄糖和脂肪酸代谢、细胞迁移、转移、药物和化疗抗性等有关[10,11]。也有学者表示,CD276抑制了T细胞的细胞毒性,这种细胞毒性允许肿瘤的增殖和转移[12]。本研究从sCD276着手,探讨其与晚期卵巢癌的联系。

在本研究中,高血清sCD276表达是晚期HGSOC患者复发或死亡的危险因素之一,同时还比较了晚期HGSOC患者肿瘤组织膜CD276表达情况与TILs的关系,发现膜CD276水平的增高与FoxP3+细胞浸润数量有一定相关性。这提示CD276在晚期HGSOC患者中有免疫调节作用。尽管大多数正常人体组织都有CD276 mRNA表达,但CD276蛋白的表达在健康人群细胞中通过严格的转录调控后是高度保守的,而其在许多肿瘤中通常以细胞外形式过度表达和升高,这说明肿瘤细胞获得了破坏CD276转录后调节的能力[13],因此血清sCD276或许能成为肿瘤免疫浸润的新型非侵入性分子标志物。

临床试验证明,PD-1/PD-L1抗体仅在25%左右的复发性卵巢癌患者中触发客观肿瘤反应,PD-1/PD-L1抑制治疗对卵巢癌的疗效有限,免疫治疗尚未成为标准治疗方案[14～16]。目前为止尚未发现与高应答率相关性强的生物分子标志物,虽然对于PD-1/PD-L1抑制治疗存在应答反应的患者,肿瘤细胞中和免疫细胞中可通过PD-L1表达情况进行评估,但其也存在局限性,需要结合病理学样本进行,同时还可能因为肿瘤的异质性,并不能保证病理学样本一定能反映疾病情况[17～19]。因此,除了PD-1/PD-L1抑制治疗外,还需寻求新的方法来针对晚期HGSOC中免疫多样性肿瘤微环境。血清sCD276作为肿瘤免疫浸润的替代标志物,除了作为一种免疫检查点分子外,还用于晚期HGSOC的肿瘤微环境免疫抑制治疗试验。国外有学者选取了147对晚期HGSOC匹配的样本,并用组织学、免疫组织化学和深入的DNA/RNA测序评估了新辅助化疗对晚期HGSOC免疫应答的影响,发现新辅助化疗增加了晚期HGSOC免疫浸润程度,导致大量CD8+T细胞表达,增强了免疫活性[20]。因此,血清sCD276作为肿瘤免疫浸润的替代分子标志物,为晚期HGSOC新辅助化疗期间的免疫应答监测提供了可能性,临床医师可考虑在化疗实施后依据晚期HGSOC肿瘤免疫浸润程度实时联合免疫抑制疗法来改善患者预后。

本研究选取了同期住院治疗的其他病理类型晚期卵巢癌进行对比,结果显示A组与B组的无病生存率比较差异无统计学意义(P>0.05),提示血清sCD276与除晚期HGSOC病理类型的晚期卵巢癌的预后无相关性。同时本研究结果显示膜CD276阳性组血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+阳性的比例均明显高于膜CD276阴性组(P<0.05),同时经多因素Cox风险回归分析模型提示,血清sCD276≥451.26 pg/ml、FoxP3+阳性是晚期HGSOC患者复发或死亡的危险因素。

综上,血清sCD276在晚期HGSOC呈高表达水平,其水平升高与TILs标志物FoxP3+T细胞数量均是晚期HGSOC患者复发或死亡的危险因素,与患者预后关系密切,同时血清sCD276除了作为一种免疫检查点分子外,还为晚期HGSOC新辅助化疗期间的免疫应答监测提供了可能性。本研究亦存在不足,研究纳入样本量少,随访时间较短,实验结果可能受样本数量、地域性差异影响,使结果存在误差,故为推动后续研究进一步深入,还需增加样本量、丰富病例的地域性,实施更长时间、更大规模的动态随访。