黏蛋白型O-糖基化与结直肠癌基础和临床研究进展

汪泽慧 张 军

南京医科大学附属南京医院消化内科（210006）

O-糖基化是指丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的羟基共价连接碳水化合物残基的过程，根据初始聚糖的不同，可进一步细分为O-连接α-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine,GalNAc）和O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖。前者最初在黏蛋白（mucin, MUC）中被发现，故又被称为MUC 型O-糖基化。MUC 型O-糖基化由多肽GalNAc 转移酶家族启动，这些酶催化GalNAc 添加到肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上，形成Tn抗原结构。正常情况下，各种糖基转移酶逐步向Tn 抗原的GalNAc 残基添加额外的糖，形成所谓的核心结构。这些核心结构可以进一步延伸，与分支构成具有生理活性的O-聚糖结构。在正常细胞中，MUC 型O-聚糖的成熟通常会被拉长并产生支链，末端最终被唾液酸或岩藻糖覆盖。癌细胞仅表达早期生物合成的中间产物，也称为截短的O-聚糖，表现为单一的GalNAc（Tn 抗原）、被唾液酸覆盖的GalNAc（sTn 抗原）或核心-1 二糖GalNAc（T 或TF 抗原），Tn 抗原、sTn 抗原和T 抗原的过度表达与结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发生和不良预后相关[1]。这些O-聚糖的截断很大程度上归因于糖基化过程中关键成分的异常或缺陷，其中包括第一步生物合成酶多肽GalNAc 转移酶家族和各类O-聚糖延伸酶，如核心1 β-1,3-半乳糖基转移酶1（core 1 beta-1,3-galactosyltransferase 1, C1GalT1）及其特定的分子伴侣Cosmc 和β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶等。本文简要综述MUC 型O-糖基化与CRC 基础研究及其临床应用的研究进展，旨在为阐明CRC 的发生、发展机制，克服肿瘤耐药，探索新型治疗手段和筛选简便高效的诊断筛查标志物提供新的思路。

一、MUC型O-糖基化与CRC的发生、发展

CRC 是全球癌症死亡的第二大病因。CRC 细胞内O-糖基化相关的糖基转移酶、分子伴侣和表面的Tn 抗原、sTn 抗原、T 抗原都存在不同程度的失调，且以自身独特方式参与了CRC 的发生和发展，包括侵袭和转移、异常凋亡和增殖、免疫逃逸等。

1.MUC 型O-糖基化与CRC 的转移：O-糖基化是蛋白质和脂质的常见修饰之一，参与许多细胞事件，从而影响肿瘤的发展和转移。Yoon 等[2]使用MUC 型O-糖基化特异性抑制剂苄基-α-GalNAc 处理MUC 高表达的HM7 结肠癌细胞株，发现癌细胞与内皮白细胞黏附分子1 的结合活性和对基质胶涂层多孔过滤器的侵袭性均显著降低。内皮白细胞黏附分子1作为识别MUC表面的唾液酸Lea和唾液酸Lex结构的关键结构，在血管内渗和（或）外渗中起重要作用。这一发现提示了异常的MUC 型O-聚糖具有促进癌细胞转移的潜力，同时验证了另一发现，即黏液性CRC 患者的预后较非黏液性CRC更差[3]。

不同于异常MUC 型O-糖基化中其他O-聚糖延伸酶的表达下调，Hung 等[4]的研究发现MUC 型O-糖基化核心1 结构的限速酶，即C1GalT1 在CRC 中通常过表达，且高表达C1GalT1 的CRC 患者5 年存活率较低表达者低20%。一方面，C1GalT1 过表达能修饰成纤维细胞生长因子受体2 上的O-聚糖并增强其磷酸化，促进了结肠癌细胞的侵袭行为和癌症干细胞样特性。另一方面，癌细胞中C1GalT1过表达可能破坏糖基转移酶之间的竞争平衡，促进与核心1相关碳水化合物结构的形成，如sTn 抗原和T 抗原。前者可以破坏半乳凝素与末端半乳糖残基的相互作用，促进单个细胞从原发性肿瘤块中释放，便于肿瘤细胞的进一步扩散和种植[1]。后者可以通过增强肿瘤细胞与半乳凝素3的相互作用，促进CRC的发生和血行传播，具体机制包括促进肿瘤细胞栓子的形成与存活、肿瘤细胞-内皮异型黏附和上皮癌细胞表皮生长因子受体的二聚化，促进其活化与信号转导[5-6]。

一项基于3 个基因表达综合数据库（GEO）的数据集（GSE37182、GSE39582、GSE103512）和癌症基因组图谱（TCGA）数据库的研究[7]发现，CRC 组织中核心3 合酶的mRNA 和蛋白表达均明显下调，是与CRC 淋巴结转移、远处转移和预后不良相关的潜在生物学标志物。通过向多种结肠癌细胞株内重新转染核心3合酶后发现，表达生成的核心3 O-聚糖可能通过MUC1/p53/miR-200c 依赖性信号级联促进CRC 细胞发生上皮-间质转化的逆转，这进一步表明了核心3 O-聚糖调节上皮-间质转化的可塑性以及控制癌症转移的潜力[8]。

作为调节C1GalT1 活性的特异性分子伴侣，Cosmc 在人类CRC 中的病理作用则存在较多争议。部分体外实验发现，Cosmc低表达通过O-糖基化机制增强了癌细胞的恶性行为，如细胞生长、黏附、迁移和侵袭[9]。然而，Huang 等[10]通过HCT116 结肠癌细胞株的研究发现，过表达的Cosmc 可以诱导异常的O-糖基化，促进结肠癌细胞的恶性表型。由此可见，Cosmc在CRC中的差异表达无法单纯用异常O-糖基化理论进行解释[11]。多种CRC 细胞株中Cosmc的表达上调，且与内质网应激之间呈现出很强的相关性。因此，Cosmc 在CRC中的病理作用机制可能是通过激活上皮-间质转化增强肿瘤的侵袭和转移，而与异常的O-糖基化无关[12]。这项研究为未来探索Cosmc与CRC之间的关系提供了新的思路。

2.MUC 型O-糖基化与CRC 细胞的抗凋亡和增殖：聚糖在各类肿瘤中通过死亡受体影响信号转导，其表达水平和结构在肿瘤进展过程中发生显著变化，且在肿瘤类型中高度可变，提示聚糖是各种癌细胞对自我程序性死亡敏感性不同的重要原因之一。

在O-聚糖延伸酶中，C1GalT1 及其分子伴侣Cosmc 具有促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL）诱导O-糖基化死亡受体DR5 寡聚化，进而起到维持死亡受体稳定的作用。TRAIL属于肿瘤坏死因子超家族的死亡配体，在各种细胞类型中表达为Ⅱ型跨膜蛋白，包括细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞。这些细胞上的TRAIL 通过与TRAIL 受体、O-糖基化死亡受体DR4 和DR5 结合来触发细胞凋亡。然而，关于Cosmc 突变的CRC 细胞株研究发现，截短的O-GalNAc 聚糖、Tn 抗原和sTn 抗原的过度表达会损害O-糖基化死亡受体DR4 和DR5 的同源寡聚化和稳定性，削弱TRAIL 诱导的细胞死亡对CRC 肿瘤细胞的清除能力，给肿瘤细胞提供了极大的存活优势[13-14]。

此外，Bagodonaite 等[15]观察到多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶6 在结肠腺癌中表达上调。为进一步明确该酶在结肠腺癌发生、发展中的作用，有研究[13]利用表达Tn抗原的人类LS174T 结肠癌细胞株构建了多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶6 的缺失模型，结果显示肿瘤细胞增殖减少且分化增强，表型也更接近正常结肠上皮细胞。另有研究发现MUC2 蛋白、C1GalT1 和Cosmc 在LS174T 结肠癌细胞株中表达均受损，进一步检测发现该细胞中的Cosmc 基因发生高甲基化。采用野生型Cosmc 转染LS174T 细胞可恢复成熟的O-糖基化，从而下调CRC 细胞的增殖和抗凋亡能力。提示异常的O-糖基化可以通过直接诱导CRC 细胞的致癌特性，促进CRC 的发展[9]。

3.MUC型O-糖基化与CRC的免疫逃逸：一般情况下，机体可以通过先天性和获得性免疫识别和杀伤突变细胞，并最终在形成肿瘤之前将其清除，即机体具有免疫监视的功能。尽管如此，仍有一定比例的肿瘤细胞可通过修饰自身表面抗原和改变肿瘤组织周围微环境等途径来逃避免疫系统的监控、识别和攻击，从而继续分裂生长，即肿瘤的免疫逃逸。有研究结果指出，人结肠癌细胞中异常的MUC 型O-糖基化可诱导Tn 抗原、sTn 抗原等过度表达，参与了肿瘤细胞的免疫逃逸[16]。

树突细胞（dendritic cell,DC）在免疫反应的启动过程中起关键作用。未成熟的DC 表达各种C 型凝集素受体摄取抗原，启动免疫抑制或免疫耐受。从人结肠癌组织中分离的MUC1-Tn 抗原可被DC 和巨噬细胞表达的半乳糖C 型凝集素识别并与其结合，使这些细胞能够抑制T 细胞免疫并促进血管生成，从而促进癌症的进展[17]。此外，使用敲除C1GALT1 基因的小鼠MC38 结肠癌细胞株研究发现，Tn 抗原的过度表达会增加骨髓来源的抑制细胞并减少CD8+T 细胞浸润，促进免疫抑制肿瘤微环境，有助于肿瘤实现免疫逃逸[18]。另一项CRC 模型研究表明，CRC 细胞中Tn 抗原的表达与错配修复缺陷状态和免疫抑制的微环境之间存在正相关性[19]。

此外，研究发现sTn 抗原通过多种途径在恶性肿瘤中发挥免疫抑制作用，包括抑制自然杀伤细胞的功能，抑制DC成熟和刺激FOXP3+T 细胞分化[16，20]。进一步使用抗聚糖单克隆抗体阻断sTn 抗原，结果发现其可以逆转癌细胞诱导的DC 成熟缺陷[20]。研究Tn、sTn 抗原与CRC 之间的相互作用为将来规避肿瘤诱导的耐受机制和药物研发提供了新的可能，有望使肿瘤细胞对抗癌疗法更敏感。

4.MUC 型O-糖基化与CRC 的耐药：尽管目前关于肿瘤的研究已取得了重大进展，但化疗的耐药性仍然是一个持续的挑战，严重影响治疗效果，也是化疗失败的重要原因之一。研究表明，MUC 表达模式的改变在诱导或减轻化疗耐药中发挥重要作用，具体机制包括调控药物转运与吸收、调节细胞凋亡途径和DNA损伤修复等。

已有研究发现，MUC1 基因在密码子600 缬氨酸被谷氨酰胺取代的BRAF（V600E）突变的CRC 中表达上调，前者可以通过激活酪氨酸磷酸酶2 和诱导受体酪氨酸激酶-Ras 蛋白-丝裂原活化蛋白激酶通路发挥CRC 对于BRAF 抑制剂的耐药机制[21]。高度O-糖基化的MUC1 还可以通过减少DNA 损伤来介导HCT116 结肠癌细胞的顺铂耐药性[22]。然而，抑制MUC13 的表达则可以通过抑制核因子-κB 信号通路加重化疗药物诱导的DNA 损伤，从而提高结肠癌细胞的药物敏感性[23]。此外，由GCNT3基因编码的MUC型核心2 1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶作为一类催化MUC 核心2 O-聚糖、核心4 O-聚糖形成的糖基转移酶，在早期CRC 中表达下调，并与CRC 预后呈正相关。有关作用机制的研究表明，该MUC 型核心2 酶的过表达有助于降低转移性CRC 细胞中的5-氟尿嘧啶耐药性[24]。因此，研发针对O-糖基化的靶向药物有可能克服耐药性的困扰，提高CRC化疗的疗效。

除了对CRC 的直接影响，MUC 型O-聚糖作为微生物群的营养来源和结合位点，还能与细菌同源受体黏附素相互作用决定肠道微生物群的组成，间接改变宿主对CRC 易感性和临床预后。如CRC 中过表达的Gal-GalNAc 可以被具核梭杆菌的Fap2蛋白识别，提高癌细胞周围特定菌群的密度，促进肿瘤的生长和存活[25]。

二、MUC型O-糖基化在CRC中的应用现况

1.MUC 型O-糖基化在CRC 临床筛查和预后中的应用：预计2030年全球将有220万CRC新病例和110万死亡病例，加快探索简便高效的CRC 生物学标志物尤为重要。一直以来，改变的糖基化谱被普遍认为是癌症标志，与癌症发展和预后不良有关。目前常用的癌胚抗原和糖类抗原19-9 等生物学标志物都是基于这些变化，常被用于CRC 的筛查和术后复发监测。sTn 抗原、Tn 抗原和T 抗原等截断的O-聚糖结构，也与恶性肿瘤的不良预后相关。在多种类型的肿瘤中均可检测到高水平sTn 抗原（>38 U/mL），其表达水平与肿瘤的大小和转移具有相关性，而患者的总体存活率则取决于癌症类型[26-27]。Tn抗原在多种腺癌中广泛表达，其表达水平与癌侵袭性之间存在明显的正相关性。研究表明，当T 抗原表达时，高微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）的CRC 患者的生存率高于微卫星稳定的患者，表明T抗原可能可以作为高MSI的CRC 患者预后更好的生物学标志物[28]。高MSI 是一种由于DNA 错配修复缺陷导致的分子表型，该分子表型与CRC 多种临床和组织病理学特征相关并影响预后，是治疗反应的预测因素[29]。

Ogawa 等[30]检测了679 例CRC 患者的GalNAc-T6 表达水平，结果显示其表达水平随着癌症的进展而降低，晚期癌症病例更有可能表现出阴性或更低水平的GalNAc-T6 表达。单变量和多变量分析表明GalNAc-T6 表达缺失是一个独立的风险变量，可提示总生存期的降低。类似的，GalNAc-T3在CRC患者中的阳性表达也提示了更高的存活率[31]。

核心2 O-聚糖合成酶也是一种良好的预后生物学标志物，其低表达可用于识别具有高复发风险的早期结肠癌患者。有研究[32]发现3 种不同作用机制的化疗药物（5-氟尿嘧啶、硼替佐米和紫杉醇）均可显著诱导癌细胞中的核心2 O-聚糖合成酶表达，这提示其也可能作为检测肿瘤对化疗反应的生物学标志物。验证这些发现还需要进一步完善前瞻性研究，并在更大规模的队列中与其他分子标志物（如Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、癌胚抗原和糖类抗原19-9 等）进行比较。

2.MUC 型O-糖基化在CRC 治疗中的应用：异常糖基化是癌症的标志，可能影响肿瘤行为的变化，其不同机制形成选择性癌症靶向治疗的肿瘤相关糖类抗原（tumor-associated carbohydrate antigens,TACA）。截短的O-聚糖（Tn、TF 和sTn抗原）即属于MUC 型O-糖基化TACA，除作为新型临床生物学标志物开发的来源，也为肿瘤免疫治疗提供了一组特定目标。起初研究人员在原发型乳腺癌患者体内检测到了抗sTn 抗体，之后在多种动物模型中也发现了sTn 疫苗和Tn 疫苗诱导抗体介导的抗肿瘤作用[33]。目前针对TACA 的肿瘤免疫治疗策略包括不同的抗体开发、疫苗的生产，如sTn、Tn相关的乳腺癌疫苗和针对乳腺癌的T 抗原特异性抗体的临床试验[34-35]。有关CRC的研究包括抗sTn抗体相关药物抗肿瘤相关糖蛋白-72 免疫脂质体，结果表明其可以显著抑制LS174T 人结肠癌细胞的体内生长和肿瘤组织的血管生成。伽妥珠单抗（gatipotuzumab）作为一种人源抗Tn单克隆抗体，在对晚期结肠癌患者进行的Ⅰ期临床试验中也显示出良好的安全性和耐受性[35]。

为了提高肿瘤的药物治疗有效率，除应加快抗肿瘤药物的研发外，还应增强药物敏感性和降低肿瘤药物的耐药率。Semba 等[36]的研究筛选了数千种化合物，在对TRAIL 敏感和耐药的结肠癌细胞株中发现强心苷海葱次甙A 可以显著增强TRAIL 诱导的细胞死亡。从机制上，其可特异性上调O-糖基化死亡受体DR4和DR5的表达并下调抗凋亡蛋白Mcl1的表达，同时显著增强了参与O-聚糖生成的多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶14、C1GalT1 及其分子伴侣Cosmc 的表达。这些酶对于O-聚糖的合成至关重要，可以使HT29 结肠癌细胞株对TRAIL 诱导的caspase-8 活化和细胞凋亡更敏感[13,37]。这些结果表明O-糖基化可以介导药物对凋亡途径的致敏作用。同时，海葱次甙A 作为一种有潜力的协调抗癌药物，将来或许可以用于CRC的免疫治疗。

三、总结

总之，基础和临床研究的证据表明，MUC 是参与结肠良性和恶性疾病发病机制的重要分子。O-糖基化作为MUC 常见的翻译后修饰之一，普遍存在于正常细胞和肿瘤细胞中。异常的MUC 型O-糖基化不仅可参与CRC 的发生、发展、转移和浸润，还与CRC 的免疫逃逸和耐药密切相关。对MUC型O-糖基化的进一步深入了解也将有助于剖析其在CRC 中的作用，为克服肿瘤耐药，探索新型治疗手段，以及寻找简便高效的诊断筛查标志物提供新的思路。