姜黄醇减轻Erastin诱导的小鼠海马神经元铁死亡的研究 *

李 玥 陈俊逾

（新疆医科大学第四临床医学院神志病科，新疆 乌鲁木齐 830099）

铁死亡是Dixon S 等［1］于2012 年提出的一种新的、铁依赖性的细胞程序性死亡。不同于传统的细胞凋亡，铁死亡兼具凋亡和坏死的形态学特点，主要表现为细胞相互分离、变小变圆，细胞膜完整但发生聚缩，无核固缩，及线粒体皱缩、线粒体嵴减少甚至消失、线粒体膜密度增加、线粒体外膜破裂等［2］。铁死亡现象广泛存在于体细胞当中，参与神经系统退行性病变的发生；铁蛋白自噬是由核受体共激活因子4（NCOA4）介导的铁蛋白吞噬过程，即NCOA4的有效结构域可以和铁蛋白重链1 亚基（FTH1）结合，形成复合物，参与溶酶体自噬，从而在细胞内释放大量铁离子［3］。已有研究［4］表明，小鼠海马神经元细胞（HT22）神经毒性模型中，铁蛋白自噬通量增加，NCOA4 和FTH1 共定位增加。目前有多种化合物被证实可以诱导铁死亡，敲低NCOA4的神经细胞对铁死亡诱导剂Erastin的敏感性减低［5，6］。

姜黄醇是传统中药莪术中的活性成分，是一种具有生物活性的小分子倍半萜化合物［7］。化学分离姜黄醇提取物后发现，姜黄醇中的酚羟基结构是其抗氧化活性基础；酚羟基甲基化具有对酚类物质的自由基清除作用，抗氧化物中酚羟基数越多，其抗氧化活性越强［8，9］。适当剂量的姜黄醇可抑制细胞氧化应激反应，抑制脑缺血再灌注损伤小鼠模型的海马神经元凋亡［10］。已有体外研究［11，12］证明，姜黄醇能够调控非Caspases 依赖的线粒体途径诱导的程序性细胞死亡，且可通过抑制Yes 相关蛋白（YAP）/NCOA4轴发挥抗铁死亡作用。亦有系统药理学研究［13］表明，姜黄醇可能通过多靶点发挥抗铁死亡作用。基于此，本研究探究姜黄醇是否可以通过调控NCOA4 介导的自噬以调控铁死亡，并发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞HT22细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0697-D）。

1.1.2 主要试剂与耗材姜黄醇、Erastin 均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；NCOA4、半胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（xCT）、FTH1、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、长链脂酰辅酶A 合成酶4（ACSL4）、β-actin抗体购自Abcam 公司；膜铁转运蛋白（FPN1）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗兔IgG 二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；CCK-8 试剂购自武汉三鹰生物技术有限公司；细胞铁含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠GPX4 酶联免疫吸附测定试剂盒购自于江莱生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞分组与处理（1）工作液的配置：①1 µM Erastin 工作液：将1 mg Erastin 加至5 mL 离心管，常温下离心2 min（转速：1000 r/min，离心半径：15.9 cm）；再加入1.8280 mL 的二甲基亚砜（DMSO）充分涡旋、混匀，即获得。②5 µM 姜黄醇工作液：将5 mg 姜黄醇溶于2.1155 mL 的DMSO 中，充分吹打、混匀；涡旋3 次，每次10 s，即获得。（2）细胞分组及给药处理：本实验分4 个实验组，即对照组、DMSO 组、Erastin 组和Erastin+姜黄醇组。细胞复苏后，传代2～3 代以获得足量HT22细胞，接种至6孔板和96孔板中；待细胞生长密度达到80%时，弃原培养基，给予含药培养基或完全培养基换液处理。①对照组：予完全培养基换液，继续培养48 h。②DMSO 组：予含0.1%的DMSO 完全培养基换液，继续培养48 h。③Erastin 组：将50 µL 的1 µM Erastin工作液溶于100 mL 完全培养基中，获得Erastin 浓度为0.5 µM 的含药培养基，给予含Erastin 完全培养基换液，继续培养24 h；更换为完全培养基，继续培养24 h。④Erastin+姜黄醇组：将50 µL 的5 µM 姜黄醇工作液溶于5 mL 完全培养基中，获得姜黄醇浓度为50 µM 的含药培养基；给予含Erastin 完全培养基换液，继续培养24 h；更换为含姜黄醇完全培养基，继续培养24 h。

1.2.2 细胞活力检测（CCK-8法）将HT22 细胞接种于96 孔板中，每组设置3 个复孔；待细胞贴壁生长密度达80%，按组别给药处理；每孔加入10 µL 的CCK-8 试剂，继续培养4 h；酶标仪562 nm 波长下检测每孔分光度，并计算不同组别的细胞活力。

1.2.3 HT22铁死亡相关蛋白表达检测（Western Blot法） 将HT22 接种于6 孔板中，待细胞贴壁生长密度达80%，按组别给药处理；干预后，每孔加入放射免疫沉淀法裂解缓冲液（RIPA蛋白裂解液），提取总蛋白，并以二辛可宁酸（BCA）法检测浓度；各组总蛋白取20 µg制备蛋白质样品；蛋白质样品经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h；加入相应一抗，4 ℃孵育过夜；加入铁自噬相关蛋白（NCOA4、FTH1）、铁死亡相关蛋白［GPX4、铁泵蛋白（FPN）、ACSL4］二抗，室温孵育2 h；加入增强化学发光法（ECL）试剂显色，并使用Image J软件分析目标蛋白灰度值。

1.2.4 细胞铁含量检测冰浴超声波破碎细胞，然后使用铁含量测定试剂盒测定铁含量。酶标仪510 nm 波长检测平均光密度值，根据标准曲线计算细胞铁含量。

1.2.5 GPX4浓度测定（酶联免疫吸附法）使用RIPA 蛋白裂解液裂解细胞，离心后取上清液，然后通过GPX4酶联免疫吸附测定试剂盒测定各组上清液GPX4 浓度。酶标仪450 nm 波长检测平均光密度值，根据标准曲线计算细胞铁含量。

1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0 分析数据，计量资料以（±s）表示，多组间比较行单因素x2分析，两两比较行SNK-q检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄醇对Erastin诱导的HT22细胞存活率影响对照组细胞与DMSO 组细胞活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Erastin组较对照组细胞活性显著降低，Erastin+姜黄醇组较Erastin 组细胞存活率显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 姜黄醇对Erastin诱导的HT22存活率影响（± s）

表1 姜黄醇对Erastin诱导的HT22存活率影响（± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与Erastin组比较，2）P＜0.05。

细胞存活率/%96.10±9.34 104.80±7.03 75.63±0.811）94.97±4.222）组别对照组DMSO组Erastin组Erastin+姜黄醇组样本数3333

2.2 姜黄醇对Erastin诱导的HT22细胞铁含量影响与对照组、DMSO 组比较，Erastin 组细胞铁含量较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与Erastin 组比较，Erastin+姜黄醇组HT22 铁含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 姜黄醇对Erastin诱导的HT22铁含量影响(± s，ng/104 cell)

表2 姜黄醇对Erastin诱导的HT22铁含量影响(± s，ng/104 cell)

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与DMSO 组比较，2）P＜0.01；与Erastin组比较，3）P＜0.01。

铁含量0.367±3.85 0.353±4.40 0.610±2.301）2）0.125±3.343）组别对照组DMSO组Erastin组Erastin+姜黄醇组样本数3333

2.3 姜黄醇对Erastin诱导的HT22细胞GPX4酶活性影响 对照组、DMSO组细胞GPX4酶活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，Erastin 组细胞GPX4 酶活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Erastin 组比较，Erastin+姜黄醇组细胞GPX4 酶活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 姜黄醇对Erastin诱导的HT22 GPX4酶活性影响（± s）

表3 姜黄醇对Erastin诱导的HT22 GPX4酶活性影响（± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与Erastin组比较，2）P＜0.05。

OD值0.30±0.03 0.32±0.02 0.24±0.051）0.44±0.122）组别对照组DMSO组Erastin组Erastin+姜黄醇组样本数3333

2.4 姜黄醇对Erastin诱导的HT22细胞铁死亡相关蛋白表达水平影响与对照组比较，Erastin 组NCOA4、ASCL4 蛋白水平显著上调，FTH1、FPN、GPX4 蛋白水平显著下调，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与Erastin 组比较，Erastin+姜黄醇组NCOA4、ASCL4 蛋白水平显著下调，FTH1、FPN、GPX4 蛋白水平显著上调，差异均有统计学意义（P＜0.01）；DMSO 组、对照组比较，上述蛋白表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表4。

图1 Western blot检测NCOA4、FPN、ASCL4、FTH1、GPX4蛋白水平

表4 姜黄醇对HT22细胞铁死亡相关蛋白表达水平影响 （± s）

表4 姜黄醇对HT22细胞铁死亡相关蛋白表达水平影响 （± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与Erastin组比较，2）P＜0.01。

组别对照组DMSO组Erastin组Erastin+姜黄醇组GPX4 0.71±0.18 0.75±0.01 0.17±0.021）0.63±0.042）样本数3333 NCOA4 0.35±0.05 0.35±0.06 1.14±0.181）0.26±0.102）FTH1 0.53±0.10 0.81±0.20 0.38±0.101）0.82±0，152）ACSL4 0.30±0.10 0.38±0.16 1.07±0.211）0.28±0.062）FPN 0.80±0.22 0.73±0.13 0.15±0.121）0.93±0.182）

3 讨论

作为近年来肿瘤、炎症、神经系统疾病及诸多领域神经退行性疾病的研究靶点，铁死亡被广泛研究。铁死亡涉及铁代谢、脂代谢、糖代谢和氨基酸代谢等多途径，而铁自噬是其最为重要的上游机制之一，NCOA4是铁自噬过程中重要的货物蛋白，在该过程中发挥重要的调节作用。

作为传统中草药莪术有效提取物，姜黄醇不仅能够发挥强抗脂质过氧化作用，且具有较好的安全性。早期动物研究［10，14］发现，姜黄醇可改善多种神经系统疾病，例如卒中和再灌注损伤、阿尔茨海默病、脑动脉粥样硬化等，具有发挥神经保护作用、治疗神经系统疾病的重要潜力［15］。并有研究［12］表明，姜黄醇可能通过调节NCOA4 发挥抗铁死亡作用。但是关于姜黄醇调控NCOA4/FTH1 作用鲜有研究。文章的创新点在于，探究了姜黄醇在体外减轻Erastin 诱导的神经元细胞铁死亡，与调节铁死亡相关蛋白表达水平、降低细胞内亚铁含量、提高细胞活力相关。如预期Erastin 可通过抑制xCT功能、降低GPX4 水平，诱导HT22 小鼠海马神经元发生铁死亡；而姜黄醇处理后，HT22亚铁含量降低、细胞活性升高，铁死亡相关蛋白GPX4、FTH1、FPN 水平升高，NCOA4、ACSL4 水平降低，提示姜黄醇在体外可以调控铁自噬，从而缓解神经元细胞铁死亡。

GPX4 是一种可以修复细胞不饱和脂肪酸氧化损伤的硒蛋白，能够特异性将具有细胞毒性的脂质过氧化氢转化为无毒性的脂醇，是保护细胞抗氧化损伤的关键酶。xCT 是由轻链的溶质载体家族7 成员11（SLC7A11）和重链溶质载体家族3 成员2（SLC3A2）构成的异二聚体，胱氨酸与谷氨酸通过System XC-在生物膜内外进行1∶1转运［16］。胱氨酸经xCT进入细胞内，被还原为半胱氨酸，进一步在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）、谷胱甘肽合成酶（GSS）作用下合成谷胱甘肽（GSH）；GSH 是体内强抗氧化物，也是GPX4 的关键辅助因子，在抗氧化应激方面发挥重要作用。xCT 被阻断时，胱氨酸无法与谷氨酸进行交换，细胞内谷氨酸堆积，过量谷氨酸具有直接细胞毒性；同时胞内GSH 合成底物胱氨酸缺乏，GSH 耗竭，导致GPX4 酶活性下降，促进铁死亡发生［17］。

已有研究［18］证明，ACSL4 是铁死亡的标记物，多不饱和脂肪酸（PUFA）在ACSL4 催化下形成多不饱和脂肪酸-酰基辅酶A（PUFA-coA），再经过酯化后插入生物膜磷脂中，形成脂质过氧化底物。Fe2+进入不稳定铁池后，部分游离铁以铁蛋白的形式储存，未结合的Fe2+由FPN 转运出细胞外，从而维持不稳定铁池稳态；FPN表达水平下降，不利于细胞内游离铁转出胞外，加速细胞铁死亡［19］。

NCOA4 作为选择性铁自噬过程中的重要调节蛋白，是靶向自噬体的货物蛋白。Mancias［3］提出了NCOA4 介导的铁自噬，还鉴定了NCOA4 和FTH1 的结合泛素化系统调节；NCOA4表达升高不仅促进细胞铁死亡，并可增加细胞对铁死亡的敏感性；FTH-1 作为细胞储铁元件之一，随细胞铁自噬增加而减少。

上述证据为本研究结果提供了理论机制，姜黄醇调节Erastin 处理后的HT22 细胞的铁死亡相关蛋白表达水平、减轻细胞内游离铁蓄积，提高了细胞活性。综上所述，姜黄醇可在体外抑制HT22 铁死亡，发挥神经保护作用。但本研究尚缺乏靶向NCOA4/FTH1 的反向验证实验，后续我们将对该方向进行深入研究。