诸氏鲻虾虎鱼胚胎及早期仔鱼发育研究

高彩霞 赖素群 曾进

(广东省实验动物监测所,广东省实验动物重点实验室,广州 510663)

诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobiuschulae)隶属于鲈形目(Perciformes)、虾虎鱼科(Gobiidae)、鲻虾虎鱼属(Mugilogobius),为暖水性小型海洋鱼类[1],广泛分布于我国南海、东海等西太平洋沿岸海域,具有体形小、繁殖量大、胚胎透明、繁殖周期短、易于人工饲养等特点,是我国目前唯一一种已制定质量控制国家标准的海水实验鱼[2-3]。目前我国已成功实现诸氏鲻虾虎鱼全人工繁育,开展了染色体组型分析[4]、全基因组测序[5]、遗传标记[1]、营养需求[6-7]、微生物控制[8-10]等生物学和质量控制技术研究,建立了封闭群和近交系[11](全同胞兄妹交配至18代),制定了诸氏鲻虾虎鱼急性毒性、摄食抑制、生长抑制、生殖毒性等一系列毒理学评价标准[12-15],并广泛应用于重金属污染物[16-17]、有机物[18]、无机物[19]、环境内分泌干扰物[20]、钻井液[21]等海洋生态毒理研究。诸氏鲻虾虎鱼的胚胎和早期仔鱼是海洋生态毒理学研究常用的实验材料,其发育研究具有重要的参考价值[22],但迄今未见相关的研究报道。

本研究观察了诸氏鲻虾虎鱼胚胎和早期仔鱼的发育特征,以期丰富其早期生物学研究基础资料和科学数据,为后续建立诸氏鲻虾虎鱼胚胎毒性试验方法提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

诸氏鲻虾虎鱼亲本取自广东省实验动物重点实验室。雄性亲本平均全长(32.15±3.12)mm,体质量为(346.23±4.83)mg,雌性亲本平均全长(29.33±4.56)mm,体质量为(254.92±7.05)mg。选取雌、雄亲鱼各10尾,按数量比1∶1配比10对亲本,分别放于繁殖缸(长20 cm、宽10 cm、高15 cm)内进行循环水养殖。养殖用水为砂滤海水,平均水温为(25.46±0.10)℃,盐度为27.00±1.00,溶解氧为(7.01±0.75)mg/L,光照时长∶黑暗时长为14 h∶10 h。每日按照鱼体质量的2%投喂1次“日清丸”牌配合饲料。

1.1.2 主要试剂与仪器

Tricaine(三卡因)麻醉剂(TCI,T0941);正置光学显微镜(徕卡,Leica DM 1000,德国)。

1.2 方法

1.2.1 产卵、孵化及胚胎的发育观察

提前2 h将鱼巢放置在繁殖缸中,每日观察亲鱼状态及产卵情况。待亲鱼自然产卵受精后,取出鱼巢,用镊子轻轻剥取10～20枚受精卵,置于滴有孵化用海水的玻片上,用Leica DM 1000正置光学显微镜观察并拍照后,将附卵鱼巢放回繁殖缸中,继续由亲鱼护理孵化。

对首次收集的受精卵连续观察5 h,其后每隔1 h另取1次受精卵观察和拍照。

1.2.2 早期仔鱼发育观察

将孵化出的仔鱼移至水温为(25.0±1.0)℃、盐度为18.00±1.00的养殖箱内饲养,定时进行光照,光照时长∶黑暗时长为14 h∶10 h,每日投喂1次轮虫作为饵料(每尾仔鱼投喂5～10个轮虫)。每天随机取10尾仔鱼,用20 mg/L Tricaine麻醉后,测量鱼体全长,用Leica DM 1000正置光学显微镜观察仔鱼的发育情况。

2 结果与分析

诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育历时73 h 20 min,所需积温为1 833.33 ℃·h。发育过程可划分为8个阶段:合子期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期、将孵期和孵化期(见表1)。

表1 诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育分期及主要特征

2.1 受精卵

诸氏鲻虾虎鱼刚产下的卵呈球状,卵径为(0.26±0.03)mm,表面有黏丝(见图1-1)。受精5 min后卵膜吸水膨胀,呈长梭状,长径为(0.81±0.05)mm,短径为(0.39±0.01)mm。有1～8个油球,多数为2～4个,卵一端具黏丝,受精卵可由黏丝相互连结、整齐地附着在鱼巢上。受精18 min后,原生质向动物极移动和集中,逐渐在动物极形成半圆形的隆起,即为胚盘(见图1-2)。

注:1.受精卵;2.胚盘隆起;3.2细胞期;4.4细胞期;5.8细胞期;6.16细胞期;7.32细胞期;8.64细胞期;9.多细胞期;10.高囊胚期;11.低囊胚期;12.原肠早期;13.原肠中期;14.原肠末期;15.胚体形成期;16.胚孔封闭期;17.视囊形成期;18.肌节出现期;19.听囊形成期;20.晶体形成期;21.心脏跳动期;22.眼黑色素期;23.胸鳍原基期;24.将孵期;25.孵化期。

2.2 卵裂期

诸氏鲻虾虎鱼的卵子为端黄卵,卵裂方式属于盘状卵裂。第1次卵裂发生在受精后35 min,从受精卵正中间开始出现分裂沟,并在5 min内完成首次分裂,到达2细胞期(见图1-3)。受精后58 min,在第1次形成卵裂面的垂直线上出现纵沟,每个卵裂球均等地一分为二,完成第2次分裂,进入4细胞期(见图1-4)。受精后1 h 21 min,发生第3次卵裂,卵裂面垂直于前两次卵裂,进入8细胞期(见图1-5)。随后,胚盘细胞每间隔20～30 min进行1次有丝分裂,依次分裂形成16细胞、32细胞、64细胞等(见图1-6～图1-8)。随着细胞的不断分裂,在整体胚盘体积无明显变化或稍有增大的情况下,胚盘细胞逐渐变小并开始层叠。单个胚盘细胞也由边界分明、清晰可见逐渐变为分裂沟纵横交错、细小而难以区分,此时进入多细胞期(见图1-9)。

2.3 囊胚期

诸氏鲻虾虎鱼受精卵经卵裂不断地细分变小,直到细胞边界模糊、难以区分。细胞层叠并隆起,囊胚吸附在动物极的绒毛膜一侧并开始包裹动物极的原生质膜,呈帽状。随着囊胚不断地扩展并包裹绒毛膜而形成囊胚腔。在受精后3 h 20 min,由于细胞分裂堆积而呈高帽状,进入高囊胚期(见图1-10);随后,细胞继续经过多次分裂,不断变小变多,胚层逐渐变薄并向下扩张,在受精后4 h 10 min,胚盘隆起变得最低,此时期为低囊胚期(见图1-11)。

2.4 原肠期

诸氏鲻虾虎鱼受精卵在受精后6 h 左右开始进入原肠胚期,此时胚体沿着卵黄囊逐渐向植物极移动,边缘细胞增多并且包裹卵黄囊。受精后6 h 20 min,胚体进一步向植物极扩张,胚盘下包至整个卵黄囊的1/3左右,此时进入原肠早期(见图1-12)。受精后6 h 50 min,原肠胚包裹卵黄囊的1/2,可明显观察到胚层包裹所形成的胚环和胚盾,此时进入原肠中期(见图1-13)。随着胚层不断地包裹、延伸,胚体下包至卵径的4/5,在受精后7 h 22 min进入到原肠末期(见图1-14)。

2.5 神经胚期

诸氏鲻虾虎鱼受精后9 h 50 min,胚环缩小,胚层细胞包围植物极,胚体背部增厚,形成神经板。胚盾伸长,卵黄栓出现,前端略膨大形成脑泡,胚体形态初现(见图1-15),受精后11 h 40 min,胚层逐渐下包收缩成1个小圆孔,进入胚孔封闭期(见图1-16)。

2.6 器官形成期

诸氏鲻虾虎鱼受精后16 h 10 min,胚体进入到器官形成期,此时头部出现1对圆形突起,克氏囊出现(见图1-17)。随着发育的进行,胚体在16 h 50 min出现3～7对肌节,此时视囊明显(见图1-18)。受精后18 h 28 min,在视囊的后面出现听囊,肌节增加至9～11对,出现尾芽,胚体出现间歇性颤动,心脏原基出现(见图1-19)。

受精后19 h 46 min,眼囊中央内陷形成晶状体,胚体头部出现椭圆形脑泡,围心腔出现,胚体背腹两处逐渐形成鳍褶,肌节逐渐呈“V”字形,胚体尾部形成褶皱,并与卵黄囊分离(见图1-20)。

受精后22 h 40 min,心室扩大、隆起,心脏形成,并开始出现微弱、有规律的搏动,频率为22～25次/min,之后逐渐加强。同时胚体头部与卵黄囊分离,向前延伸,与腹部几乎成直线,尾鳍继续延伸,可见明显的胚体摆动,视泡更为明显(见图1-21)。

受精后40 h 42 min,晶体周围出现黑色素,眼逐渐变黑,此时进入眼黑色素期。该时期胚体背部出现点状、块状色素斑;心跳127～130次/min,身体血管开始分化,血液呈微红色;肌节增至26～28对,尾部摆动明显(见图1-22)。受精后43 h 30 min,胸鳍原基期出现,尾部延伸弯曲至头部,卵黄囊和油囊变小,心跳增至178～183次/min,胚体继续延长(见图1-23)。

2.7 将孵期及孵化期

受精后71 h 30 min,胚体发育至将孵期。此时卵膜变薄,胚体尾部弯曲超出头部,尾部摆动频繁且剧烈,胚体可在膜内有力扭动,胸鳍分化呈半圆形,卵黄囊明显缩小,此时心跳可达到217～219次/min(见图1-24)。受精后73 h 20 min,胚体扭动剧烈,尾部不断拍击卵膜,仔鱼通过头部或尾部挣破卵膜,陆续孵化而出(见图1-25)。

2.8 诸氏鲻虾虎鱼仔稚幼鱼形态学观察

刚出膜的诸氏鲻虾虎鱼全长为(1.50 ±0.01)mm,体色透明。出膜后健康仔鱼游动剧烈,初孵仔鱼眼睛呈黑色椭圆形,2块圆形的耳石位于眼睛后方。在仔鱼腹部,可观察到油囊位于卵黄囊中间,在腹腔上方有黑色的鳔原基,在鳔原基的后方有一黑色细长的肾脏,肾脏与消化道末端的膀胱相连,消化道呈透明、折叠状(见图2-1)。刚出膜的仔鱼有集群趋光的特点。孵出24 h后,仔鱼全长为(1.97±0.03)mm,卵黄囊和油囊变小,体色稍有加深,尾柄处散射的黑色素增多(见图2-2)。孵出36 h后,部分仔鱼可开口摄食轮虫,肠道中分布少量食物,肠道蠕动增加,体循环清晰可见(见图2-3)。孵出72 h后,仔鱼全长为(2.11±0.02)mm,卵黄囊和油囊消失,此时大部分仔鱼可摄食轮虫,肠道蠕动加快,消化道褶皱增加,具有排泄功能。仔鱼形态纤长,尾鳍膜弧度增加,呈扇形轮廓,放射状纹路更加明显;游动更为活跃,可在水中平游,具有喜光、集群的特点(见图2-4)。孵出120 h后,仔鱼全长(2.28±0.04)mm,尾鳍开始分化;肠管加粗,内壁的皱褶更加发达。此时仔鱼可大量摄食轮虫,肠道中充满食物,尾柄处放射状色素加深,头部鳃盖骨已较发达,上下颌出现细小的颌齿(见图2-5),具有较强的游动能力。孵出10 d后,仔鱼全长为(3.27±0.19)mm,尾鳍逐渐分化成半圆形,可见鳍条,第1及第2背鳍开始分化;肠道褶皱增加显著,腹部膨大,肠道内容物显著增多,可摄食卤虫无节幼体。仔鱼身体透明度降低,色素主要分布于腹侧及身体中后段体侧(见图2-6)。

注:1.初孵仔鱼;2.24 h仔鱼;3.36 h仔鱼;4.72 h仔鱼;5.120h仔鱼;6.10 d仔鱼。

3 讨论

诸氏鲻虾虎鱼卵为黏性卵,未受精的卵呈圆球状,表面有一层薄膜,有黏丝包裹在膜表面。受精卵吸水后表面的黏丝分离,并形成附着丝黏附在鱼巢上,卵膜隆起,并与卵球分离,形成长梭状的卵。受精卵的一端悬浮在水中,另一端黏附在鱼巢上,这与纹缟虾虎鱼(Tridentigertrigonocephalus)受精卵的形态相似[23]。

诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育过程中,自然孵化的适宜水温为24.6～25.6 ℃,在此温度下,胚胎孵化率高,仔鱼活力好,畸形率低。多数研究表明,胚胎发育过程受温度的影响最为显著[24-25],温度过高或者过低都可能导致胚胎发育不完善。在适当的水温范围内,升高水温会加快胚胎发育进程,缩短孵化时间,但此时仔鱼器官发育不够完善,适应外界环境的能力较弱,因此仔鱼的畸形率偏高[26-27],鱼苗的死亡率较高;而在水温偏低的情况下,胚胎发育变得缓慢,仔鱼孵化时间延长,常常导致胚胎在膜内停留太久而缺氧,胚胎的孵化率降低,死亡率显著增高[28]。

与其他虾虎鱼相比,诸氏鲻虾虎鱼在自然产卵受精并由亲鱼孵化的情况下,当水温维持在25.6 ℃左右,其孵化出膜时长约为73 h,孵出的仔鱼活力好,开口摄食时间早。同为虾虎鱼科的伊夫林虾虎鱼(Gobiosomaevelynae)受精卵在水温25 ℃时历时168 h孵化出膜[29];粘皮鲻虾虎鱼(Mugilogobiusmyxodermus)受精卵在水温16～18 ℃条件下历时138 h出膜[30];红头虾虎鱼(Elacatinuspuncticulatus)受精卵在水温(26±0.48)℃时需要168 h以上孵化出膜[31];胡须虾虎鱼(Sufflogobiusbibarbatus)受精卵在水温17 ℃时需要7 d才孵化出膜[32];纹缟虾虎鱼在水温17～25 ℃条件下历时156.5～257.2 h孵化出膜[23]。虾虎鱼科不同物种之间,其孵化温度及时长存在明显差异,这可能与物种类别及生殖孵化环境的差异相关。除水温外,胚胎发育的出膜时长也与受精卵本身的质量相关,同时可能与受精卵黏附在鱼巢的位置有关[30]。同一批卵,黏附在鱼巢的不同位置,其胚胎的发育是不同步的。此外,水流对胚胎发育及出膜时长也有明显的影响。李建军等[28]观察发现,在鱼巢边缘位置,受水流刺激比位于中央更多,因此边缘位置的鱼卵发育更快。本研究在诸氏鲻虾虎鱼繁殖缸内放置鱼巢供亲鱼产卵,观察发现,位于鱼巢边缘的胚胎,其出膜时间稍早于位于鱼巢中央的胚胎,推测与受到较多的水流刺激有关。除此之外,海水鱼类受精卵的孵化速率与卵径的大小可能呈正相关,卵径越大,孵化时间越久,初孵仔鱼个体也越大[33]。与其他的虾虎鱼相比,诸氏鲻虾虎鱼的受精卵较小,产卵量较多,其胚胎孵化出膜的时间也较短。

在诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育的8个阶段分期中,器官形成期累计积温最高,发育时间最长,约占整个发育周期的75.45%。其中心脏跳动期到眼黑色素期持续18 h左右,这期间心脏的跳动频率由22～25次/min加强到了127～130次/min,同时到达眼黑色素期,并且在出膜前眼睛发育完成,有色素沉积,同时形成眼囊、胸鳍、心脏、消化道等器官,初孵仔鱼就具备了较为完善的内脏器官,能更好地适应外界环境[34]。这是虾虎鱼的普遍特性[31]。

诸氏鲻虾虎鱼胚胎在受精后73 h 20 min开始出膜,75 h左右可以全部孵化出膜。初孵仔鱼平均全长为1.50 mm,孵化后生长状态好,存活率高。孵出36 h后,部分仔鱼开口摄食轮虫,此时卵黄囊和油囊消失;孵出120 h后,仔鱼可大量摄食轮虫,其游动迅速,有趋光性和聚集性。

诸氏鲻虾虎鱼胚胎发育时间较短,总积温低于其他虾虎鱼。初孵仔鱼开口摄食早,生长状态好,可进行人工繁育,符合实验动物基本要求。本研究初步描述了诸氏鲻虾虎鱼胚胎和早期仔鱼的发育特点及生长特性,可为后续开展诸氏鲻虾虎鱼胚胎或早期仔鱼毒性试验研究提供参考。