人工养殖长江鲟后备亲本血液生化指标研究

李远兰 张涛 冯广朋 庄平 章龙珍

(1 中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090;2 湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州 313000)

长江鲟(Acipenserdabryanus)又名达氏鲟,隶属于鲟形目(Acipenseriformes)、鲟科(Acipenseridae)、鲟属(Acipenser),是我国特有的淡水鲟类。该鱼主要分布于长江中上游,常栖息于河流较浅、水流较缓的湾沱处,除产卵外,进行不定期洄游[1]。长江鲟曾是我国重要的渔业捕捞对象,由于受到航运、过度捕捞、水体污染和水电工程建设等人类活动的干扰,长江鲟野生种群资源逐渐衰退,其商业捕捞活动于1983年被禁止,1988年长江鲟被列为国家一级保护动物[2]。为保护长江鲟,科研人员在长江鲟的种群生态[3]、人工繁殖[4]、早期发育[5]、分子遗传[6]和营养需求[7]等方面进行了许多研究。

动物的血液具有物质运输、生理调节及生理防御等重要作用[8]。鱼类的血液生化指标能反映鱼体的健康状况、营养水平等正常生理状态[9],同时也能为鱼类的繁殖生理及病理研究等提供重要参考依据[10]。目前国内学者已对中华鲟[11]、史氏鲟[12]、匙吻鲟[13]和西伯利亚鲟[14]等鲟类的血液学开展了较多的研究,但有关长江鲟血液生化指标的研究鲜有报道。本研究拟通过检测人工养殖长江鲟后备亲本血清生化指标,掌握长江鲟血液生化指标的健康参数参考范围,丰富长江鲟血液生化指标数据库,为长江鲟的物种保护提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

试验鱼为人工养殖的长江鲟后备亲本,无伤无病,健康活泼。共检查测定8尾鱼,其全长为(153.13±16.50)cm,体长为(123.75±15.08)cm,体质量为(57.56±10.34)kg。

长江鲟养殖在室内圆形水泥池中进行。水泥池直径4.5 m,高2.0 m,养殖水深为1.0 m。养殖期间,每天定时(7:00、13:00、19:00)用温度计检测养殖车间的环境室温,用YSI综合水质分析仪检测养殖水体的水温、pH、溶解氧(DO)等水质指标。11月—次年4月,使用曝气后的自来水进行养殖,水温维持在10～20 ℃;5月—10月,使用“百诺肯”养殖制冷恒温机(型号BN-5A)给水体降温,水温保持在(25±1)℃;养殖水体长年不间断曝气并安装断气报警器,溶解氧保持在5 mg/L以上。养殖期间,pH保持在7.8～8.2,氨氮保持在0～0.1 mg/L。每日换水,采用边进水边排水的换水方式,换水量约为总水量1/3。每隔7 d在长江鲟进食3 h后用聚维酮碘溶液进行消毒,用量为0.75 mL/m3。

饲养方法:人工养殖长江鲟的饲料为8号鲟鱼全熟化水产配合饲料(宁波天邦股份有限公司),按照“定时、定点、定质、定量”原则进行投饲管理。采用人工定点投饲的方式,于每日早上(7:00)和晚上(16:00)各投喂1次,日投饲量约为长江鲟总体质量的3%。投饲1 h后,用吸污管吸出剩余残饲,以减少对养殖水体的污染。当水质异常或鱼摄食异常时,需适当减少投饲量。

1.2 方法

1.2.1 血样采集与血清制备

2021年4月,在长江鲟的臀鳍后方尾静脉处使用20 mL无菌注射器匀速抽取血液,并立即分装至10 mL洁净离心管中,室温下放置4 h后,使用高速冷冻离心机以3 000 r/min的速度离心10 min。离心完成后,取上清液置于2 mL离心管中,于-80 ℃超低温冰箱中冻存,待测。

1.2.2 血液生化指标测定

泌乳素(prolactin,PRL)、皮质醇(cortisol,CORT)、雌二醇(estradiol,E2)、睾酮(testosterone,TTE)、生长激素(growth hormone,GH)、甲状腺素(thyroxine,T4)、促甲状腺素(thyrotropin,TSH)采用电化学发光法测定;胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)与三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)采用化学发光法测定;总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、溶菌酶(lysozyme,LZM)、己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)采用可见光法测定;钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)、钙(Ca)和镁(Mg)离子使用电解质分析仪进行检测。

1.2.3 数据处理

利用变异系数[15]评价人工养殖条件下长江鲟各血液生化指标的变异程度。计算公式为:

变异系数=(标准差/平均值)×100%

(1)

研究数据通过EXCEL 2003软件整理分析,结果用(平均值±标准差)表示。使用SPSS 21.0软件进行独立样本t检验,对雌、雄组间进行差异显著性分析,设P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同个体人工养殖长江鲟后备亲本血液生化指标差异

人工养殖长江鲟后备亲本血清激素的部分测定结果见表l。结果显示,血清激素中皮质醇(CORT)的变异系数最小,为16.90%;促甲状腺素(TSH)的变异系数最大,为92.81%。此外,试验检测出3项指标的浓度范围:睾酮(TTE)浓度的最小值小于0.03 ng/mL,最大值大于15.00 ng/mL;泌乳素(PRL)浓度均小于1.00 μIU/mL;甲状腺素(T4)浓度的最小值为0.01 nmol/L,最大值为10.65 nmol/L。

表1 人工养殖长江鲟后备亲本的血清激素指标值

人工养殖长江鲟后备亲本血清抗氧化与免疫指标的测定结果见表2。结果显示,抗氧化酶中CAT活力为(2.54±1.39)U/mL,其变异系数最大;SOD活力为(585.99±87.23)U/mL,其变异系数最小;免疫指标LZM的活力为(847.83±287.46)U/mL,其变异系数为33.91%。

表2 人工养殖长江鲟后备亲本血清抗氧化和免疫指标值

人工养殖长江鲟后备亲本血清离子和能量代谢酶指标的测定结果见表3。结果显示,血清离子中Mg2+的浓度最低,为(1.76±0.66)mmol/L,其变异系数最大;Na+的浓度最高,为(136.85±14.83)mmol/L,其变异系数最小。能量代谢酶中PFK活力为(5.23±3.08)nmol/(min·mL),其变异系数最大;PK活力为(39.22±10.78)U/L,其变异系数最小。

表3 人工养殖长江鲟后备亲本的血清离子和能量代谢酶指标值

2.2 不同性别人工养殖长江鲟后备亲本血液生化指标差异

人工养殖长江鲟后备亲本雌性和雄性个体各项血液生化指标的差异见表4。由结果可以看出,人工养殖长江鲟的血清激素、血清抗氧化指标、血清免疫力指标和血清能量代谢酶等血液生化指标的P值均为P>0.05,血清离子中,除K+的P<0.05(P=0.02)外,其他血清离子的P值均为P>0.05。

表4 人工养殖长江鲟血液生化指标的性别差异

3 讨论

3.1 人工养殖长江鲟血液生化指标的特点

人工养殖长江鲟血液各项生化指标的参数变化范围较大,这与鲤科[16]、鲶形目[17]和鲈形目[18]鱼类相似。本研究中检测的8尾人工养殖长江鲟,其全长最小值(128 cm)与最大值(180 cm)相差52 cm,体长最小值(102 cm)与最大值(146 cm)相差44 cm,体质量最小值(43.65 kg)与最大值(72.90 kg)相差29.25 kg。人工养殖长江鲟不同个体间较大的生长状况差异,可能导致各项血液生化指标值的差异较大。

鱼类血液生化指标能反映鱼类的生理状况和健康状况,正常情况下这些指标是相对稳定的,但当鱼体生长环境改变或发生病变时,一些生化指标会发生明显改变,因此,这些血液生化指标可作为鱼类毒理学和生物监测的工具[19]。在本研究中,CORT、SOD、GSH-PX、K+、Na+与Cl-等血液生化指标变异系数均小于20%,具有一定的稳定性,可作为血液生化参考指标用来监测长江鲟的状态。鱼类的血液生化指标还受多种因素的影响,如水温、季节、性别、年龄和营养状况等都会影响鱼类的血液生化指标值[20]。虽然GH等13项血液生化指标的变异系数较大,但在一定程度上仍可以反映长江鲟的生理状况。本研究是以人工养殖的健康长江鲟后备亲本作为对象,其生化指标值范围对于评价人工养殖长江鲟的健康程度具有借鉴意义。

3.2 人工养殖长江鲟血液生化指标的性别差异

尽早鉴定长江鲟的性别对于后续开展繁育工作十分重要。然而,由于长江鲟没有第二性征,无明显的外部特征进行性别区分[21],因此对其进行性别鉴定较为困难。当前鲟鱼的性别鉴定技术,如微创手术、内窥镜和B超检测等都需要在鱼体生长到较大个体甚至性成熟后才较为有效,且进行鉴定时会对鲟鱼造成不同程度的损伤[22]。张涛等[14]进行基于血液生化指标判别分析西伯利亚鲟性别及卵巢发育时期的研究发现,西伯利亚鲟的总胆固醇、低密度脂蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶在雌、雄个体间有显著差异。可见,性别会影响鱼类的血液生化指标[23]。通过血液生化指标来鉴定长江鲟的性别不仅成本低,还能降低对鱼体的损伤。本试验结果显示,雌性长江鲟血液中K+的含量显著高于雄性个体(P<0.05),可考虑将其作为人工养殖长江鲟性别鉴定的依据。今后可以继续探寻长江鲟雌、雄个体间具有显著差异的血液生化指标,以便综合地依靠血液生化指标来判定其性别。

3.3 人工养殖长江鲟与中华鲟血液生化指标的比较

在现存的鲟类中,长江鲟与中华鲟亲缘关系最接近。在进化上,有学者认为达氏鲟可能是中华鲟的陆封种群[24]。因此,将长江鲟与中华鲟的血液生化指标进行比较具有重要的生物学意义。参考张海耿等[25]和章龙珍等[26]的研究结果,人工养殖长江鲟与中华鲟部分血液生化指标的比较见表5。

表5 人工养殖长江鲟与中华鲟血液生化指标的比较

有研究发现,IGF-1过高会抑制鱼类的生长[27]。本研究中人工养殖长江鲟的IGF-1为(16.79±3.86)μg/L,而张海耿等[25]测定的中华鲟的IGF-1超过100 μg/L。根据这一结果,长江鲟的生长速度可能比中华鲟快。

生物体通过代谢会产生活性氧(ROS),过量的ROS自由基会损害生物体的组织器官[28],但生物体内的抗氧化系统可以清除生物体内过量的ROS。SOD和CAT是抗氧化酶系统十分重要的功能酶[29],GSH-PX是清除ROS极其重要的非酶抗氧化物质[30]。MDA是脂质过氧化反应的产物,可间接体现机体的抗氧化能力[31]。LZM是生物体非常重要的免疫因子,通过破坏革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖来瓦解细菌细胞[32]。与张海耿等[25]测量的中华鲟血液生化指标相比,本研究中人工养殖长江鲟血液中的SOD含量[(585.99±87.23)U/mL]远远大于淡水养殖的中华鲟[(135.64±25.62)U/mL]。长江鲟一直生活在长江里,其体温变化较小,可能有利于促进SOD的合成,从而使长江鲟的抗氧化能力更强。此外,人工养殖长江鲟血液中的LZM含量也远大于中华鲟,说明长江鲟可能具有更强的免疫力。人工养殖长江鲟血液中的GSH-PX、CAT、MDA活性与中华鲟基本相同。试验表明,人工养殖长江鲟总体上比中华鲟具有更强的抗氧化能力和免疫力。原因可能是:中华鲟属于海河洄游鲟类,较大幅度的水温变化会影响其SOD的活性,当受到细菌或病毒侵袭时,中华鲟机体免疫细胞会产生更多的自由基物质进行抵御,影响了免疫基因的表达量,从而减弱了中华鲟的抗病效果[33];与之相比,长江鲟的体温变化幅度较小,促进了长江鲟免疫相关基因的表达,从而表现出更强的免疫力。

血清离子对于维持与调节鱼类的渗透压有着直接的作用。相比章龙珍等[26]测得的中华鲟血清离子含量,人工养殖长江鲟血液中K+的含量较低,Na+、Cl-、Ca2+和Mg2+含量略高,总体上,人工养殖长江鲟血清离子含量略高于中华鲟。通常鲟类可进行低渗调节和高渗调节,当渗透调节达到平衡时,其体内的血清离子达到新的平衡点。本研究表明,长江鲟血清离子的平衡点要高于中华鲟。由于长江鲟对盐度的耐受能力取决于其渗透调节能力和能量代谢水平[34],而长江鲟属于淡水性洄游鱼类,与中华鲟相比,其盐度耐受能力较弱,不需要提供比中华鲟更多的用于高渗调节的能量,因此其能量代谢可能较弱。

3.4 下一步研究计划

我国科研人员于1983年首次攻克了长江鲟人工繁殖技术,于2007年成功实现了全人工繁殖。中国水产科学研究院长江水产研究所也于2013—2015年连续3年进行长江鲟全人工繁殖并获得了成功[35]。但目前长江鲟的野外繁殖尚未成功。国际自然与自然资源保护联盟(IUCN)发布的全球濒危物种红色目录的更新报告显示,2022年7月21日,“中国淡水鱼之王”白鲟被正式宣布为灭绝,中华鲟位列极危等级,长江鲟(达氏鲟)升级为野外灭绝[36],可见长江鲟野外种群已岌岌可危。为拯救保护长江鲟,我国农业农村部组织编制并发布了《长江鲟(达氏鲟)拯救行动计划(2018—2035年)》纲领性方案,积极开展长江鲟的抢救性保护工作,目前已经取得了重大成效。然而,长江鲟的自然种群仍面临着严重威胁,保护工作任重道远。科学基础研究是国家保护政策的指南针,本试验是拯救行动研究项目中的一小部分,目前已获取了一些基本参数,对于后期开展研究积累了基础数据。但由于长江鲟样本数量有限,本试验采样条件较为单一,在以后的研究中,建议开展分季节、分时段采样分析,争取掌握长江鲟各血液指标的变幅及波动规律,为长江鲟的物种保护提供基础资料。

4 结论

通过测定人工养殖长江鲟后备亲体的血液生化指标,发现长江鲟不同个体间大部分血液生化指标变异较大,这可能与长江鲟生长状况差异较大有关。通过对雌、雄个体的血液生化指标进行对比,发现不同性别个体血液中的K+含量差异显著,其他指标则差异不显著,因此可考虑将K+作为人工养殖长江鲟性别判定的依据。此外,人工养殖长江鲟后备亲本的CORT、SOD、GSH-PX、K+、Na+与Cl-等血液生化指标变异系数<20%,可作为长江鲟状态健康与否的参考监测指标。