犬羊膜有效成分的测定及保存条件的筛选

张佳韧，李 慧，王瑛琪，张 备，薛沾枚，赵 灿，生树新，邬立刚*

（ 1. 黑龙江农业职业技术学院动物科学系，黑龙江 佳木斯 154002；2. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005 ）

羊膜是一种起源于胚胎外胚层的多功能组织，位于胎膜最内层，具有抗炎、抗新生血管生成、免疫调节、抗菌、抗纤维化、组织相容性良好等特性。羊膜是具有运输功能的上皮细胞，常作为上皮基底膜替代物广泛应用于眼部上皮组织修复，特别是眼表化学烧伤的治疗[1-4]。人羊膜中存在转化生长因子-β1（TGF-β1）、神经生长因子受体、肝细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子等潜在的有效成分[5-7]。同时，人羊膜中存在的羊膜上皮干细胞和人羊膜间充质干细胞具备分化成成纤维细胞的能力[8]，生物羊膜具备广阔的临床应用背景[9]。新鲜羊膜由于不易获取、难以长期保存、手术缝合操作复杂等因素限制了其在眼病治疗领域的应用。因此，羊膜上清液成为新鲜羊膜重要的替代产品。羊膜上清液对角膜损伤具有良好效果。蒋爱华[10]研究证明，羊膜提取液治疗鼠角膜碱烧伤与羊膜覆盖效果相当。也有研究发现，羊膜上清液可促进犬角膜溃疡后角膜愈合，减少角膜瘢痕，但羊膜有效成分还未进行进一步测定[11]。本研究从3种羊膜上清液的制备方式中筛选最佳制备条件，同时从不同的保存条件中筛选最佳保存条件，并通过试验检查羊膜的一些有效成分，以期为揭示羊膜作用机制提供思路，为进一步利用羊膜及羊膜制品奠定基础，为羊膜上清液制备及动物临床试验提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 新鲜犬羊膜

试验所用的10 份新鲜羊膜（健康犬剖腹产的胎盘组织）来自校外实训基地动物医院。术前对所有孕犬进行血液常规检查、血液生化检查、犬瘟热抗原检测、犬细小病毒抗原检测、犬冠状病毒抗原检测和犬布鲁氏杆菌抗体检测，检查结果均未见异常。

1.1.2 仪器与试剂

台式高速离心机、低温多样品组织研磨仪、微量组织匀浆研磨仪均购自天根科技有限公司；超净工作台购自中国检测仪器；酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司。

庆大霉素、两性霉素购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM 液购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司；生理盐水购自青州尧王制药公司；犬血管内皮细胞生长因子（bFGF）、基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP）、肝细胞生长（HGF）、TGF-β1 ELISA试剂盒以及BCA法蛋白含量测定试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 犬羊膜上清液制备

通过剖腹产取出的新鲜胎盘被放置在无菌容器内，在超净工作台内使用含有抗生素的生理盐水对新鲜胎盘进行彻底清洗，反复进行3次以去除胎盘及相关附属组织，仅剩羊膜及绒毛膜组织。使用组织剪钝性剥离羊膜及绒毛膜，剔除羊膜中间的血管，完成剥离后使用含有抗生素的生理盐水对羊膜进行反复冲洗3次。灭菌滤纸吸干羊膜上的水分，处理好的新鲜羊膜按照湿重5 g/份的标准进行统一剪切，随机混合，为试验1和试验2提供羊膜样品库。

1.2.2 试验设计

1.2.2.1 试验1：处理方式对羊膜有效成分的影响

试验分为常温研磨组（C组）、低温研磨组（D组）、干燥研磨组（G组）。每组均取10份羊膜样本，C组和D组均使用高速组织研磨仪对每份羊膜样本进行研磨，其中C组常温研磨，D 组研磨过程中加入液氮，保证低温环境研磨；G组羊膜样本在35 ℃下低温烘干24 h后再进行常温研磨。高速研磨仪按照12 000 r/min 研磨5 min。充分研磨后加入离心管，按照质量比1∶1加入PBS磷酸盐缓冲液进行稀释。稀释后样本在摇床上充分振荡20 min 后置于4 ℃高速离心机中8 000 r/min离心10 min，取上清液。

1.2.2.2 试验2：保存方式对羊膜有效成分的影响

试验分为DMEM研磨组、DMEM湿重组和冻干粉组，每组均取10份羊膜样本。其中DMEM研磨组的新鲜羊膜均参考试验1 的低温研磨组（D 组）方式进行研磨，之后将新鲜羊膜直接制备成冻干粉；DMEM研磨组将冻干粉按质量比1∶1与DMEM液混合，使用细菌滤膜过滤后封装在无菌的0.5 mL离心管内；冻干粉组未加DMEM液，其余步骤按照DMEM 研磨组无菌保存在离心管内；DMEM 湿重组直接将新鲜羊膜储存在DMEM 液中，使用时再进行低温研磨，开展检测或应用。

1.2.3 犬羊膜上清液中相关成分含量检测

将羊膜上清液制备当天记为第0 d，试验1按要求每组随机选3 份样品，同试验试剂一同置于室温自然回温1 h。试验2于第0、20、40、80 d，每组分别随机取出3份样品，同试验试剂一同置于室温自然回温1 h。

1.2.3.1 犬羊膜上清液中的有效成分含量

将50 μL不同浓度的标准品及试验样品加入包被好的孔板中。之后在每个标准品孔和羊膜上清液孔添加辣根过氧化酶（HRp）100 μL，使用封板膜封板后，置于恒温箱孵育60 min。去除孔板液体，拍干，使用350 μL 清洗液洗板5次。彻底洗净后，添加底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。最后加入终止液50 μL，15 min 内用酶标仪在波长为450 nm 测定各孔中的吸光度（OD）值，根据不同浓度的标准品所测的OD值绘制标准曲线。再根据各样品的OD值，依据标准曲线测算相关有效成分含量。

1.2.3.2 蛋白含量

配置工作液，根据需要量按要求将试剂A和试剂B按50∶1的比例混合，盖紧后充分混合；酶标仪预热30 min，调节波长562 nm，蒸馏水调零。工作液60 ℃水浴预热30 min。按照蒸馏水4 μL、标准品4 μL、待测液4 μL、工作液200 μL的剂量将对应试剂添加到96孔板中测定。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 制备方法对犬羊膜上清液中有效成分含量的影响（见表1）

表1 制备方法对犬羊膜上清液中有效成分含量的影响Tab.1 Effect of preparation methods on the concentrations of active ingredient in canine amniotic membrane supernatant

由表1 可知，D 组犬羊膜上清液中bFGF 含量为73.58 ng/L，G 组的bFGF 含量为69.36 ng/L，D 组极显著高于G 组（P＜0.01）；D 组犬羊膜上清液中TIMP、HGF、TGFβ1的含量均显著高于G组（P＜0.05）。

2.2 保存条件对犬羊膜上清液中有效成分的影响

2.2.1 保存条件对犬羊膜上清液中bFGF 含量的影响（见表2）

表2 保存条件对犬羊膜上清液中bFGF含量的影响Tab.2 Effect of storage conditions on bFGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 单位：ng/L

由表2可知，第0 d，3组羊膜上清液中的bFGF含量在两个保存温度下差异不显著（P＞0.05）；第20 d时，在4 ℃和-18 ℃条件下，冻干粉组bFGF 含量显著低于DMEM 研磨组和DMEM 湿重组（P＜0.05）；第40 d 时，在4 ℃和-18 ℃条件下，冻干粉组bFGF含量极显著高于DMEM研磨组和DMEM 湿重组（P＜0.01）；第80 d，在4 ℃和-18 ℃条件下，冻干粉组bFGF 含量极显著高于DMEM 研磨组和DMEM湿重组（P＜0.01）。在-18 ℃条件下，第80 d 时冻干粉组犬羊膜上清液中bFGF含量显著高于4 ℃（P＜0.05）。

2.2.2 保存条件对犬羊膜上清液中TIMP 含量的影响（见表3）

表3 保存条件对犬羊膜上清液中TIMP含量的影响Tab.3 Effect of storage conditions on TIMP concentrations in canine amniotic membrane supernatant 单位：ng/L

由表3 可知，第0、20 d，3 组羊膜上清液中TIMP 含量在两个保存温度下差异不显著（P＞0.05）；第40 d时，-18 ℃条件下，冻干粉组羊膜上清液中TIMP 含量显著高于DMEM 研磨组和DMEM 湿重组（P＜0.05）；第80 d，冻干粉组羊膜上清液中TIMP 含量极显著高于DMEM 研磨组和DMEM湿重组（P＜0.01）。

2.2.3 保存条件对犬羊膜上清液中HGF 含量的影响（见表4）

表4 保存条件对犬羊膜上清液中HGF含量的影响Tab.4 Effect of storage conditions on HGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 单位：μg/L

由表4 可知，第0 d，3 组羊膜上清液HGF 含量在两个保存温度下差异均不显著（P＞0.05）；第20 d 时，相同保存温度下，冻干粉组羊膜上清液HGF 含量极显著低于DMEM研磨组和DMEM湿重组（P＜0.01）。

2.2.4 保存条件对犬羊膜上清液中TGF-β1 含量的影响（见表5）

表5 保存条件对犬羊膜上清液中TGF-β1含量的影响Tab.5 Effect of storage conditions on TGF-β1 in canine amniotic membrane supernatant 单位：μg/L

由表5 可知，第0、20 d，3 组羊膜上清液中TGF-β1 含量在两个保存温度下差异均不显著（P＞0.05）；第40 d 时，-18 ℃条件下冻干粉组犬羊膜上清液中TGF-β1含量显著高于4 ℃条件（P＜0.05）；第80 d 时，在相同保存温度下，冻干粉组-18 ℃条件下均极显著高于DMEM 研磨组和DMEM湿重组（P＜0.01）。

3 讨论

羊膜制品作为羊膜组织制备得到的潜在治疗药物，已在犬、兔子、大鼠等动物上进行了大量的试验，研究显示了羊膜制品安全性良好，具备促进伤口愈合，特别是角膜愈合的能力。王艳[12]发现，采用羊膜移植术治疗角膜碱烧伤，羊膜具有抑制炎症反应、抑制血管新生和瘢痕的形成、促进角膜损伤愈合的作用，对犬角膜碱烧伤具有一定临床疗效。蒋爱华[10]发现，羊膜提取液治疗鼠角膜碱烧伤，可以有效抑制炎症和后期新生血管再生，促进角膜上皮愈合，减少角膜混浊，对碱烧伤角膜具有综合疗效，效果与羊膜移植相当。但是目前对羊膜有效治疗成分的研究较少，作用机制尚不明确。

本试验采用3种不同制备方式对羊膜中潜在成分进行测定，结果发现，羊膜中含有较高成分的蛋白，蛋白质作为实现生物功能的重要物质，为羊膜制品发挥治疗效果提供了可能。同时，本试验检测了羊膜上清液中bFGF、TIMP、HGF、TGF-β1 的含量，并显示存在较高的组织浓度，与Dua等[13]和Choi等[14]的研究结论相符。

bFGF 是调控创面愈合的重要细胞因子，可增强细胞的有丝分裂活性，促进细胞快速分裂增殖。罗文娟等[15]研究表明，相对浓度为10 μg/L的bFGF具有促进猫角膜内皮细胞增殖的作用。本试验检测结果已经达到此浓度，因此，bFGF 可能在羊膜制品促进伤口愈合过程中发挥了重要作用。TIMP 作为基质金属蛋白酶的抑制剂，可有效降低基质金属蛋白酶（MMP）的浓度，改善创伤部位炎症反应，以避免出现“呼吸爆发”。赵平等[16]研究发现，羊膜移植治疗角膜碱烧伤术后，角膜中MMP 含量降低，TIMP 升高，表明羊膜可能通过提高角膜表达TIMP 的水平抑制MMP。本试验继续补充了这一结果，提示羊膜不仅能够提高角膜中TIMP 的表达，羊膜上清液作为外用滴眼液还可以提供一定的补充，但检测到的TIMP浓度较低，其在治疗过程中发挥的作用还需继续研究。

HGF作为一种多效生长因子，能够促进角质细胞的增殖和迁移，以剂量依赖的方式促进毛细血管出芽生长和创面的再上皮化，发挥促进损伤修复的作用[17]。本试验发现，随着保存时间延长，HGF下降非常明显，表明现有保存条件不足以维持HGF含量长期稳定，需要继续寻找适宜保存条件。TGF-β1 是一种多效能生长因子，具有促血管生成、调节内皮细胞基因表达、增加包括胶原蛋白、纤维蛋白在内的细胞外基质形成等功能[18]。本试验在羊膜中检测到了较高浓度的TGF-β1，侧面证明了羊膜治疗角膜损伤时早期出现大量新生血管，TGF-β1可能发挥了重要作用。

本试验发现，现阶段保存条件下，随着保存时间延长，羊膜中潜在有效成分出现不同程度的衰减，添加DMEM液对减缓早期有效成分含量下降起到了一定作用。但是中期保存时间不佳，可能是水溶液的环境加速了生物活性物质的降解。冻干粉作为一种重要的保存形式，虽然保存前期有效成分含量依然会有下降，但中期保存稳定性更好，可能相对干燥低温的环境延缓了生物活性物质降解。在相同保存液条件下，-18 ℃更有利于保存。4、-18 ℃是大多数使用场景可提供的保存环境，普通使用场景难以提供-80 ℃或更低的温度。此外，是否研磨对保存在DMEM液中的羊膜的有效成分的影响不显著。由于DMEM保存液中存在一定浓度的蛋白质，但本试验未对蛋白质含量进行检测，待后续发现更好的检测蛋白质含量手段，再对蛋白保存过程中的含量变化进行记录。

4 结论

本试验发现，犬羊膜存在一定含量的蛋白成分，同时存在不等含量的bFGF、TIMP 和TGF-β1 等具备生物学活性的有效成分，可能通过以上有效成分的作用路径实现其作用效果。添加DMEM保存液成分的羊膜制品适合短期保存，冻干粉剂型适合中期保存，低温冷冻（-18 ℃）可有效延缓相关有效成分的降解。本研究结果为犬羊膜中短期保存提供了一定参考。