川牛膝对淡水石斑鱼部分血清抗氧化指标的影响

孙晓旺，郑艳坤，马 林，李明泽，尤宏争，毕相东，孙学亮*

（ 1. 天津市水产研究所，天津 300221 ；2. 天津市农业发展服务中心，天津 300161 ； 3. 天津农学院，天津 300192 ）

淡水石斑鱼（Cichlasoma managuense）属于脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、辐鳍亚纲，别称石斑鱼。淡水石斑鱼原产自中美洲尼加拉瓜，广东、江西等养殖单位引入后进行推广养殖[1]。淡水石斑鱼具有生长速度快、耐低氧、抗病力强等特点，不仅肉质鲜美、营养丰富，而且外形美观、体态优美，既可以作为商品鱼食用，还可以作为观赏鱼，是一种值得推广的淡水优良品种[2]。近年来，国内外学者对淡水石斑鱼的养殖技术愈发重视，淡水石斑鱼的养殖规模也越来越大，逐渐成为淡水养殖中的重要品种[1-3]。

川牛膝（Radix cyathulae）属于植物界、被子植物门、双子叶植物纲、苋科，别称白牛膝、拐牛膝、肉牛膝，为苋科植物川牛膝的干燥根[4]。采集时需秋、冬二季采挖，除去芦头、须根及泥沙，烘或晒至半干，堆放回润，再烘干或晒干[5]。其味甘、微苦，性平，具有逐瘀通经，通利关节、利尿通淋等功效[5]。川牛膝用于治疗经闭症瘕、胞衣不下、跌扑损伤、风湿痹痛、足痿筋挛、尿血血淋等[5]。张钰芹等[6]研究发现，牛膝多糖还可通过调控肿瘤的微环境，改善机体的血液流变性，起到抑制肿瘤细胞生长的作用。

目前，国内外学者对淡水石斑鱼的研究主要集中在养殖繁育、肌肉营养等方面，川牛膝作为添加剂对淡水石斑鱼的体内抗氧化性的相关研究尚未见报道。本研究使用中草药川牛膝添作为饲料添加剂饲养淡水石斑鱼，旨在研究和评价川牛膝对淡水石斑鱼体内抗氧化性的影响，为淡水石斑鱼的健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用450 尾淡水石斑鱼，购自天津市七里海水产养殖场。平均体长（15.20±1.20） cm、体质量（50.20±2.30） g，随机分为5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，饲养于15 个长38 cm×宽26 cm×高36 cm 的水族箱中。水温为（37.0±0.5） ℃，pH 值7.24，溶氧为6.0～6.2 mg/L。饲料选用福州海马牌石斑鱼商品饲料（Q/FZHM 005），饲料营养水平见表1，每日投喂饲料量约为鱼体重的1%。试验用川牛膝购自天津市中草药店，选取川牛膝植物根茎，使用研磨机械充分研磨成粉状。

表1 试验饲料营养水平Tab.1 Nutrient levels of the experimental diets 单位：%

1.2 试验设计及饲养管理

试验设置5 个浓度梯度，在基础饲料中分别添加0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的川牛膝（包括1个对照组和4个浓度梯度试验组），每组设3个重复。试验期间，每天9：00和15：00分别对应投喂含不同川牛膝浓度的饲料，每日投喂饲料量约为鱼体重的1%。每日密切观察受试淡水石斑鱼的状态，若发现鱼体死亡，则及时捞出，称重，记录。

1.3 测定指标及方法

分别在试验开始第7、第14、第21 和第28 d 对试验鱼进行采样，每个水族箱中每次取5条受试淡水石斑鱼。使用2 mL注射器从受试淡水石斑鱼的尾柄处插入受试鱼体的动脉中采集血液，注入已标记好的离心管中，离心管中事先加入适量肝素，防止血液凝固，将已标记好的离心管放入冰水中，避免无关因素对试验造成影响。取完同一水箱的鱼血液样品，4 ℃冰箱内保存，并在1 d内对血液进行离心处理（4 ℃、4 000 r/min 离心10 min）。使用南京建成生物科技有限公司试剂盒对各血清样品测定抗氧化指标，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 软件对数据进行初步整理与统计，SPSS 19.0 统计软件进行方差分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 川牛膝对淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性的影响（见表2）

表2 川牛膝对淡水石斑鱼血清GSH-Px活性的影响Tab.2 Effect of Radix cyathulae on the serum GSH-Px activity of the Cichlasoma managuense 单位：U/mL

由表2 可知，试验第14 d 时，0.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px活性显著高于对照组、1.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验第7 d和21 d时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性显著高于0.5%川牛膝添加组和1.5%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验28 d时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px活性显著高于对照组（P＜0.05），但与其余各浓度组相比差异不显著（P＞0.05）。

对照组淡水石斑鱼在试验第7、第21 d 时淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性显著高于试验第14、第28 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第21 d 时的血清GSH-Px活性显著高于试验第14、第28 d（P＜0.05）。

2.2 川牛膝对淡水石斑鱼血清SOD活性的影响（见表3）

由表3 可知，试验第7 d 时，对照组淡水石斑鱼血清SOD 活性显著高于1.0%川牛膝添加组、1.5%川牛膝添加组、2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验第14、第21 d 时，1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清SOD活性显著高于对照组（P＜0.05）；试验第28 d 时，对照组淡水石斑鱼血清SOD 活性显著低于各试验组（P＜0.05）。对照组淡水石斑鱼试验第7 d 时的血清SOD 活性显著高于试验第28 d（P＜0.05）；1.0%川牛膝添加组、1.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第14 d 时的血清SOD 活性显著高于试验第21 d时（P＜0.05）；且1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第14 d时的血清SOD活性最高（P＜0.05）。

2.3 川牛膝对淡水石斑鱼血清CAT活性的影响（见表4）

表4 川牛膝对淡水石斑鱼血清CAT活性的影响Tab.4 Effect of Radix cyathulae on the serum CAT activity of the Cichlasoma managuense 单位：U/mL

由表4可知，试验第7 d时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清CAT活性显著高于对照组和1.0%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验第14 d 时，0.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清CAT 活性显著高于2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验第21、28 d 时，1.5%川牛膝添加组CAT 活性显著高于2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）。0.5%川牛膝添加组各时间点淡水石斑鱼的CAT 活性差异不显著（P＞0.05）；1.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第28 d 时的血清CAT 活性显著高于其他时间点（P＜0.05）；1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第21 d 时的血清CAT 活性显著高于试验第7 和第14 d（P＜0.05）；2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第7 d时的血清CAT活性最高，显著高于其他组（P＜0.05）。

2.4 川牛膝对淡水石斑鱼血清MDA含量的影响（见表5）

表5 川牛膝对淡水石斑鱼血清MDA含量的影响Tab.5 Effect of Radix cyathulae on the serum MDA concentration of the Cichlasoma managuense 单位：U/mL

由表5可知，对照组淡水石斑鱼在试验第7 d时的血清MDA 含量显著高于其他时间点（P＜0.05），且显著高于1.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）。试验第14 d 时，1.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清MDA 含量显著高于试验第7 d 时（P＜0.05）。试验第21 d 时，0.5%川牛膝添加组和1.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清MDA 含量显著低于试验第28 d 时（P＜0.05）。试验第28 d 时，0.5%川牛膝添加组、1.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清MDA 含量显著高于对照组（P＜0.05）。

2.5 川牛膝对淡水石斑鱼血清T-AOC的影响（见表6）

表6 川牛膝对淡水石斑鱼血清T-AOC的影响Tab.6 Effect of Radix cyathulae on the serum T-AOC of the Cichlasoma managuense 单位：U/mL

由表6可知，试验第7 d时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清T-AOC 显著高于其他组（P＜0.05）；试验第14 d时，0.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清T-AOC显著高于对照组、1.0%川牛膝添加组和1.5%川牛膝添加组（P＜0.05）；试验第21 d 时，0.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清T-AOC 显著高于对照组（P＜0.05）；试验第28 d 时，1.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清T-AOC显著高于对照组、0.5%川牛膝添加组和2.0%川牛膝添加组（P＜0.05）。

1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼试验第28 d 时淡水石斑鱼的血清T-AOC 显著高于试验第7、第14 d（P＜0.05）。2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼各时间点的血清T-AOC差异均不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 川牛膝对淡水石斑鱼血清GSH-Px活性的影响

GSH-Px是机体内广泛存在的一种活性氧自由基清除剂，与CAT和SOD共同组成了机体的抗氧化防御系统[7-8]。GSH-Px 能够清除机体内的过氧化氢和脂质过氧化物，阻止活性氧自由基对生物体内的损伤，确保机体正常的生命活动[9]。本试验结果表明，试验第14 d 时，0.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px活性显著高于对照组、1.5%和2.0%川牛膝添加组；试验第21 d时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性显著高于0.5%、1.0%和1.5%川牛膝添加组，表明川牛膝对GSH-Px的影响在逐渐累积。试验28 d 时，2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性显著高于对照组，但与其余各添加组相比差异不显著，表明试验第21 d 与28 d 间淡水石斑鱼血清GSH-Px 活性存在一个峰值。2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼各时间点的血清GSH-Px活性存在显著差异，其中试验第21 d 时的血清GSH-Px 活性显著高于试验第14 d 和28 d。综上所述，川牛膝添加量为2.0%时，淡水石斑鱼血清GSH-Px活性在试验第21 d时显著高于其他时间点，在21 d 与28 d 之间到达峰值，之后下降；川牛膝浓度为0、0.5%、1.0%、1.5%时，各时间点测得的数据之间差异不显著。结果表明，川牛膝浓度为2.0%时对淡水石斑鱼血清GSH-Px活性的影响较明显。这与唐静[10]研究中对小鼠灌胃不同剂量的川牛膝后，T-SOD、CAT、GSH-Px 的活性和T-AOC均有不同程度的升高的试验结果基本吻合。

3.2 川牛膝对淡水石斑鱼血清SOD活性的影响

SOD 别名肝蛋白，是一种内源性抗氧化金属酶，能够消除生物体在新陈代谢过程中产生的自由基和活性氧，防止脂质过氧化，还具有抗衰老的特殊效果[11-13]。倪青松等[14]用含不同浓度川牛膝的饲料饲喂仔鸡7 d，发现川牛膝多糖可通过提高血清抗氧化性指标水平提高机体的免疫能力。本试验中，对照组淡水石斑鱼血清SOD活性随时间推移逐渐降低，试验第28 d 时活性显著低于第7 d 时。通过饲料中加入川牛膝，试验第28 d 时，各添加组淡水石斑鱼血清SOD活性均显著高于对照组；其中，1.0%、1.5%、2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清SOD活性的峰值均出现在试验第14 d，之后出现不同程度的下降，在试验第28 d时略有回升。与1.0%、2.0%川牛膝添加组相比，1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清SOD活性除在试验第7 d时略低外，在其余各时间点均为最高。综上所述，川牛膝对淡水石斑鱼血清SOD的作用效果在试验第14 d时最为明显，且川牛膝添加浓度为1.5%时效果最佳。这与玄一凡等[13]得出的在虹鳟饲料中添加2%复方中草药能够增强虹鳟幼鱼血清SOD活性的研究结果相似，表明饲料中适量添加中草药能够提升鱼类的抗氧化性能，但过量添加反而会降低鱼类抗氧化性，对鱼体产生不良影响。

3.3 川牛膝对淡水石斑鱼血清CAT活性的影响

CAT 是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶[15]。CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一[15-16]。罗李媛等[17]从川牛膝中提取川牛膝多糖，测定并证实其参与了机体的细胞免疫和体液免疫，从而提高机体的免疫力；川牛膝还具有促进动物体生长发育的功能。本试验中，试验第21 d 时，1.5%川牛膝添加组淡水石斑鱼血清CAT活性显著高于试验第7、第14 d，说明在添加浓度为1.5%，川牛膝对淡水石斑鱼血清CAT活性具有明显的增强效果；试验第28 d时，2.0%川牛膝添加组CAT活性显著低于其余各组，说明淡水石斑鱼血清CAT 活性在试验第21 d 和第28 d 之间存在一个最低值。根据这一特性，在生产中可根据实际需求适当调节川牛膝的添加浓度。综上所述，CAT对川牛膝的刺激反应非常灵敏，但注意在实际生产中不宜持续性地使用川牛膝增强淡水石斑鱼的CAT活性。

3.4 川牛膝对淡水石斑鱼血清MDA含量的影响分

MDA 由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得，可在高真空下升华精制，主要用于医药中间体或感光色素的原料[18]。在生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，更具有潜在的致癌性[18-19]。由于动物肉品变质主要是由于脂类物质的氧化，而MDA作为脂类物质的氧化产物，其含量可间接反映动物脂类氧化的程度[20]。本试验结果显示，受试淡水石斑鱼血清MDA 含量对于川牛膝的刺激在低浓度时（如0.5%、1.0%）反应较迟缓，在试验第21 d时，川牛膝才开始对MDA指标产生影响。川牛膝添加浓度为1.5%和2.0%时，淡水石斑鱼血清MDA含量在试验第7 d和第14 d时存在显著差异。因此，在一定的范围内，随着川牛膝添加浓度升高可增加鱼血清MDA 的含量。试验第21 d 时，饲料中添加低浓度的川牛膝（如0.5%、1.0%），淡水石斑鱼血清MDA 含量显著低于对照组和其他添加组，表明较低浓度的川牛膝可在试验第21 d 时降低淡水石斑鱼血清MDA 含量，降低鱼体内脂类的氧化程度。

3.5 川牛膝对淡水石斑鱼血清T-AOC的影响

T-AOC 能够反映鱼体抗氧化能力的总体表现，是机体防御体系中酶促及非酶促中各因子抗氧化能力的总和，可较为全面地体现鱼体抗氧化酶系统和非酶促系统对外界不良因素刺激的代偿能力[19]。王丽新[21]通过观察黄芪提取液对自然衰老小鼠皮肤中T-AOC、ATP 酶活性的影响及小鼠皮肤组织结构在用药前后的变化，证明了黄芪提取液在延缓小鼠皮肤自然衰老方面的作用。本试验中，除2.0%川牛膝添加组淡水石斑鱼各时间点的血清T-AOC不存在显著差异外，其余各浓度组之间均存在显著差异；饲料中川牛膝添加浓度为1.0%时，试验第28 d时，淡水石斑鱼血清T-AOC 最高。综合而言，川牛膝对淡水石斑鱼血清T-AOC的影响效果呈波浪形。唐静[10]给小鼠灌胃不同剂量川牛膝多糖，发现小鼠体内的T-SOD、CAT、GSH-Px的活性和T-AOC 均有不同程度的升高，这与本试验结果基本吻合。

4 结论

不同浓度的川牛膝作为饲料添加剂能够对淡水石斑鱼血清抗氧化指标产生影响。在各添加浓度下，川牛膝对淡水石斑鱼血清GSH-Px、CAT活性在试验第21 d时的影响效果最明显，而SOD 活性、MDA 含量与T-AOC 在试验28 d时达到最大值。研究表明，川牛膝对淡水石斑鱼的抗氧化功能具有促进作用，但每项抗氧化指标的最适浓度不同；为提高其血清GSH-Px、CAT、SOD 的活性和T-AOC，降低MDA 含量，在养殖过程中可预先添加0.5%川牛膝，再根据实际情况适量增加川牛膝的添加浓度，以达到最优的养殖效果。