液相色谱-质谱联用技术分析秦巴硒菇提取物活性成分及其治疗慢性粒细胞白血病的网络药理学研究

王东萍,葛万文,邵 晶,孙延庆

(1. 甘肃中医药大学中西医结合学院,甘肃 兰州 730000;2. 兰州大学第二医院, 甘肃 兰州 730030;3. 甘肃中医药大学药学院,甘肃 兰州 730000;4. 甘肃省人民医院, 甘肃 兰州 730000)

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种骨髓增殖性造血系统恶性肿瘤,由9号和22号染色体易位所致,易位产生了费城染色体[1]。该易位编码具有酪氨酸激酶活性的蛋白,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的出现明显改善了CML患者的治疗和预后,但在治疗过程中约有33%的患者出现了耐药[2]。在治疗过程中药物的副作用、停药后疾病复发、耐药的出现导致治疗失败疾病进展等仍是该疾病治疗过程中需重点解决的问题。

植物源性天然产物在血液系统恶性肿瘤中具有显著的药理作用,近年来受到广泛关注。食用和药用蘑菇中因含有凝集素、精氨酸、麦角甾醇、β-葡聚糖等多种活性物质,所以具有促造血,抗炎,抗过敏,抗肿瘤,抗感染等多种生物学活性[3]。秦巴硒菇(Agaricus blazei Murill, AbM)是一种食药兼用的真菌,秦巴硒菇提取物是从秦巴硒菇中获得的酸性RNA蛋白质复合物,在前期的研究中发现,该提取物表现出对多发性骨髓瘤[4]、白血病[5]等的抗肿瘤活性,与化疗药物3′-叠氮-3′-脱氧胸腺核苷抗胃癌亦有协同和增敏作用[6]。

随着生物信息学的快速发展,网络药理学和分子对接技术为揭示中医药的复杂机制以及药物、靶点和疾病之间的相互关系提供了一种新的方法,有助于观察药物对疾病的治疗作用[7]。本研究以液相色谱质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析明确秦巴硒菇提取物中的活性成分,应用网络药理学与分子对接相结合的方法预测秦巴硒菇提取物治疗CML的可能作用机制,并通过体外实验进行进一步的验证。

1 材料

1.1 试剂与仪器胎牛血清:购自以色列BI公司;CCK-8试剂盒:购自奥默生物技术有限公司;SDS-PAGE试剂盒:购自上海雅酶生物医药科技有限公司;PVDF膜:购自德国Merck millipore公司;Akt、mTOR、β-actin一抗:购自美国Abcam公司;PI3K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗:购自美国CST公司。超高效液相色谱质谱联用仪1290 UHPLC Q Exactive Focus(美国Agilent公司产品),色谱柱ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm Col(美国Waters公司产品),Mulltiskan FC型酶标仪(美国ThermoFisher公司产品),Tanon 5200 Multi 全自动化学发光图像处理系统(上海天能科技有限公司产品)。

1.2 细胞株及其培养K562细胞株由本实验室保存;K562细胞置于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基中,在37℃、5% CO2且饱和湿度的无菌培养箱中培养。根据细胞生长状况,取细胞状态良好处于对数生长期的细胞用于实验。

1.3 秦巴硒菇提取物秦巴硒菇:购自陕西紫阳有限公司,秦巴硒菇提取物的分离纯化由中国科学院兰州化学物理研究所天然药物重点实验室完成,具体提取方法已有报道[6]。简而言之,将500 g干燥除杂的秦巴硒菇粉碎,通过乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析对提取物进行纯化得到4.86 g提取物,灭菌后贮存于4 ℃备用。

2 方法

2.1 秦巴硒菇提取物主要成分筛选及成分靶点的预测称取100 mg样本,加入500 μL提取液(甲醇 ∶水=4 ∶1);涡旋30 s,45 Hz匀浆4 min,冰水浴超声1 h;-40 ℃静置1 h后将样本在4 ℃,12 000 r·min-1离心15 min;小心地取上清经0.22 μmol·L-1微孔滤膜过滤;后上机检测。通过Swiss Target Prediction数据库(http://www. swisstargetprediction.ch/) 检索秦巴硒菇提取物中活性成分相对应的潜在作用靶点,去除重复项,获得各活性成分的靶点。

2.2 疾病靶点的获取从GeneCards (https://www.genecards.org/), DisGeNET (https://www.disgenet. org/)数据库检索与CML相关的靶点,将不同数据库的靶点合并去重,得到CML的相关靶点基因。将药物靶点数据集和疾病靶点数据集取交集,绘制韦恩图,即为秦巴硒菇提取物治疗CML的共同靶点。

2.3 蛋白-蛋白互相作用(PPI)网络的构建为了进一步分析秦巴硒菇提取物治疗白血病的关键靶点,将获得的交集靶点导入STRING (https://cn.string-db.org/)数据库,以combined score >0.9为筛选条件,获得各靶点相互作用关系,将数据导入Cytoscape3.9.1软件构建PPI网络。

2.4 基因功能与通路富集分析为明确秦巴硒菇提取物治疗CML靶点的基因功能及主要信号通路,将获取的共同靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) 进行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括三个主要组成部分生物过程(biological process, BP),分子功能(molecular function, MF)以及细胞组分(cellular component, CC)。KEGG通路富集分析用于阐明秦巴硒菇提取物治疗CML的潜在作用机制。本研究根据P值大小,分别选择前10位的GO条目及前20位的KEGG通路,利用在线工具绘制气泡图。

2.5 分子对接从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库获得蛋白大分子结构,通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得药物活性成分的SDF结构,DockThor (https:// dockthor.lncc.br/v2/) 进行分子对接[8],对接结果通过Pymol软件进一步处理。

2.6 CCK-8法测定K562细胞的IC50取对数生长期细胞,调整细胞密度,以每孔5×103个接种于96孔板中,以本课题组前期研究为依据,设置实验组药物浓度为0.5、1、1.5、2、2.5、3 g·L-1,同时设立对照组(常规培养,不加药物)和空白组(加入培养基,不加细胞)。细胞置于37 ℃,5% CO2饱和湿度恒温培养箱中分别培养24 h和48 h。每孔各加入10 μL CCK-8试剂共孵育2 h,Mulltiskan FC型酶标仪测定450 nm处吸光度。使用GraphPad Prism 8计算其IC50值。

2.7 Western blot检测相关蛋白的表达水平K562细胞经不同浓度药物(0、0.5、1 g·L-1)处理后收集,预冷PBS洗涤,加入细胞裂解液重悬细胞,4 ℃条件下,12 000 r·min-1、30 min离心,收集上清,BCA法测定各组蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,5% BSA室温封闭2 h,一抗4 ℃条件下孵育过夜。TBST洗涤后加入二抗,室温孵育1 h,TBST漂洗。ECL超敏发光剂显色后经Tanon 5200 Multi全自动化学发光图像处理系统分析相关蛋白表达。

3 结果

3.1 秦巴硒菇提取物化学成分的筛选秦巴硒菇提取物利用超高效液相色谱质谱联用仪进行检测。使用控制软件(Xcalibur, Thermo Fisher Scientific)控制下基于FullScan-ddMS2功能进行一级、二级质谱数据采集。将数据进行记录、分析和处理,结果见Fig 1。通过LC-MS检测发现秦巴硒菇提取物的主要化合物共有126个,运用Swiss Target Prediction网站检索药物成分靶点并去重后共获得相关靶点1 150个。

Fig 1 Ion flow diagram of LC-MS

3.2 靶点基因的获取以“CML”为关键词,在GeneCards数据库检索疾病靶点,依据相关性得分(Relevance score ≥ 1),共检索到靶点基因数目357个。在DisGeNET数据库中共检索到疾病靶点基因503个,两个数据库筛除重复靶点后共获得靶点数718个。将活性成分的治疗靶点和疾病靶点取交集,获得172个共同靶点。见Fig 2。

3.3 PPI网络的构建将秦巴硒菇提取物靶点基因与CML靶点基因通过绘制韦恩图,将所得的172个交集基因导入STRING数据库,获取靶蛋白互作网络。运用CytoScape软件,绘制出PPI网络图。见Fig 3。连接相关靶点最多的前3种成分分别是杨芽黄素、异欧前胡素、欧前胡素。使用cytoHubba插件获得PPI网络中的核心子网络。其中,TP53具有最高的度值,能与272个蛋白发生相互作用关系;其次为GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1等,揭示这些靶点在整个网络中起关键作用,是秦巴硒菇提取物成分治疗白血病的关键靶点。见Fig 4。

Fig 2 Venn diagram of drug targets and disease targets

Fig 3 PPI network

3.4 GO和KEGG通路富集分析通过DAVID数据库对交集靶基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析分别显示潜在靶点显著富集的前10个条目,其中BP与信号传导、蛋白质磷酸化、细胞内信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等过程相关。参与的MF包括蛋白质及ATP结合,蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。见Fig 5。KEGG主要涉及癌症通路、PI3K/Akt、MAPK信号通路、细胞凋亡等信号通路。见Fig 6。

3.5 分子对接利用分子对接技术,将秦巴硒菇提取物中的主要活性成分分别与PI3K/Akt/mTOR 信号通路中的关键靶点蛋白进行对接:PI3K(PDB:2v1y)、AKT1(PDB:1h10)、mTOR(PDB:6m4u)。结合能越小提示对接效果越好。结果显示三种主要成分与PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键靶点蛋白都有良好的结合能力,可形成结合能低、活性高、结构稳定的构象。见Tab 1,Fig 7。

Fig 4 Core candidate target genes

Fig 6 KEGG enrichment analysis

Tab 1 Molecular docking binding energies(kcal/mol)

3.6 秦巴硒菇提取物抑制K562细胞增殖CCK-8法检测结果显示:秦巴硒菇提取物对K562细胞有抑制增殖的作用,呈时间依赖性和浓度依赖性,作用于K562细胞24 h和48 h的IC50分别为1.86和1.48 g·L-1,差异有统计学意义。见Fig 8。

3.7 K562细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达比较采用Western blot法检测PI3K,Akt,mTOR蛋白表达量。实验结果显示秦巴硒菇提取物对PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平影响不大。进一步检测蛋白磷酸化水平,结果表明在不同浓度的秦巴硒菇提取物干预作用下,能以剂量依赖性的方式下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达。见Fig 9。

4 讨论

在本研究中,通过液相色谱质谱分析秦巴硒菇提取物中的化合物,共发现126种化合物。在这项研究中,杨芽黄素是最显著的生物活性化合物,其次是异欧前胡素、欧前胡素等,提示为秦巴硒菇提取物的核心成分。杨芽黄素是来源于植物的一种黄酮类化合物,具有抗肿瘤逆转耐药、抗氧化、抗菌、抗炎等多种生物学作用[9]。异欧前胡素和欧前胡素是呋喃香豆素类化合物,在体外实验发现异欧前胡素对人肺癌、卵巢癌、皮肤癌、中枢神经系统等多种肿瘤细胞均具有不同程度的抗肿瘤作用[10]。欧前胡素除了有抗炎、抗氧化作用外,对胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤有抗肿瘤作用,其可与化疗药物发挥协同效应,逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性同时降低化疗药的毒副反应[11]。上述活性成分在秦巴硒菇提取物治疗CML的过程中起非常重要的作用。

Fig 7 Molecular docking diagrams between Tectochrysin and A PI3K B Akt C mTOR

Fig 8 Effects of different concentrations of drug and at different time periods on K562 cells )

PPI结果显示秦巴硒菇提取物可能通过TP53、GAPDH、STAT3、CTNNB1、AKT1、VEGFA、JUN、mTOR等靶点治疗CML。p53是肿瘤抑制因子,是细胞周期和凋亡的主要调节因子,在白血病及多种肿瘤中因突变而失活,有研究表明p53激活剂可能是治疗慢性粒细胞白血病的有效方法[12]。伊马替尼耐药的BCR-ABL阳性细胞系中GAPDH过表达,用RNA干扰的方法敲除GAPDH,可增加耐药细胞对伊马替尼的敏感性[13]。在CML中,细胞受到刺激后STAT3被活化,在肿瘤细胞生长增殖、对化疗药物产生耐药和能量代谢失调中起关键作用[14]。CTNNB1也被称为β-catenin,是Wnt/β-catenin信号通路的核心蛋白,在急性髓系白血病和CML中白血病干细胞的自我更新,增殖和分化中起重要作用[15]。在PI3K/Akt/mTOR信号通路中,Akt被认为是PI3K的主要下游效应分子,可使激活的糖原合成酶激酶-3β激酶阻止细胞周期蛋白D1的降解和凋亡相关因子的激活,从而加速细胞周期发育,最终促进细胞增殖。mTOR被认为是PI3K/Akt/mTOR信号通路下游的另一个组成部分,也可以被Akt磷酸化。mTOR不仅可以整合上游信号,还可以调节P70核糖体S6蛋白激酶和4E结合蛋白1的磷酸化,从而直接促进细胞生长[16]。综上所述,以上蛋白都可作为秦巴硒菇提取物治疗CML的靶点蛋白,充分体现了秦巴硒菇提取物多成分多靶点治疗疾病的特点。

Fig 9 Effect of drug on expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in K562 cells

KEGG通路富集分析结果显示,PI3K/Akt信号通路富集的基因数目较多,是治疗白血病的关键通路。研究表明,PI3K/AKT/mTOR信号通路是参与细胞增殖、凋亡和转移的主要信号通路,该通路在CML疾病的发生发展中起重要作用。在CML中,BCR-ABL蛋白能持续激活PI3K/Akt/mTOR等下游信号通路,最终导致白血病细胞无限制的克隆性增殖。BCR-ABL通过两种途径影响PI3K/Akt/mTOR通路:直接通过PI3K的磷酸化;间接地通过下调或导致该信号通路的天然抑制剂磷酸酶及张力蛋白同源物的功能受损[17]。PI3K/ Akt/mTOR信号通路的失调可能导致下游信号分子的激活,PI3K是由两个亚单位组成的异二聚体,包括调节亚单位和催化亚单位,当细胞受到生长因子刺激时,PI3K被激活并聚集在细胞膜上,将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,然后磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸激活下游Akt通过磷酸化下游mTOR促进细胞生长。PI3K/Akt/mTOR通路在CML中的失调已成为药物研究和开发的热点,抑制该信号通路在各种类型的癌症,特别是血液恶性肿瘤中表现出令人鼓舞的结果[16]。MAPK信号通路也与细胞增殖、分化、迁移、衰老和凋亡等多种生物学行为有关。在许多研究中,ERK和JNK的抑制剂有效地促进了白血病细胞的凋亡,表明抑制该信号通路可治疗白血病[18]。

分子对接结果显示,秦巴硒菇提取物的主要活性成分杨芽黄素、异欧前胡素、欧前胡素与核心靶点具有较好的结合能力,说明活性化合物与核心靶点存在相互作用,且可以形成结合能低、活性高、结构稳定的构象。这些靶点基因主要涉及参与调节细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡,免疫调节等方面。综上所述,说明秦巴硒菇提取物可能通过与核心靶蛋白互作,作用于PI3K/Akt/mTOR等多条信号通路发挥促进白血病细胞凋亡、调节细胞周期等作用。

本课题组已经对PI3K/Akt/mTOR信号通路及凋亡、细胞周期进行了相关研究,后续研究还可选择MAPK、JAK/STAT3通路,MicroRNAs in cancer中的ABCB1、ABCC1、ABCG2等与白血病耐药相关的基因进行深入研究。

中药及提取物在治疗白血病方面疗效显著,但由于其存在多成分、靶点不明确、作用机制复杂等问题。本研究采用液相色谱质谱联用技术分析提取物中的有效成分,再结合网络药理学和分子对接的方法,揭示了秦巴硒菇提取物通过多个靶点、多种信号通路在白血病的治疗中发挥作用。并通过CCK-8、Western blot实验验证上述部分筛选结果,实验结果表明秦巴硒菇提取物可以抑制白血病K562细胞增殖,并下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR磷酸化蛋白的水平,对CML具有良好的抑制效果。