桔梗-姜半夏配伍促进小鼠NK细胞在肺脏募集并抑制肿瘤肺脏转移

王 悦,张 玥,孔令婉,张 珊,杨雯越,姚成芳,

[1. 山东中医药大学中医药创新研究院,山东 济南 250355;2. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)临床与基础医学院,山东 济南 250117;3. 山东中医药大学中医学院,山东 济南 250355]

肺脏肿瘤是一种高发病率、高致死率疾病[1],在发展早期主要依赖NK细胞等淋巴细胞发挥抗肿瘤作用[2],其中CXCR3+NK细胞可依赖CXCL9/10等趋化因子的招募作用[3]而快速迁移,并大量分泌IFN-γ和穿孔素等效应因子,发挥免疫监视等作用[4]。

桔梗-姜半夏配伍(the combination ofPlatycodonGrandiflorumandPinelliaTernata, PG+PT)常用于肿瘤的临床治疗中[5]。本研究旨在探讨PG+PT对肺脏肿瘤微环境中NK细胞、特别是CXCR3+NK的免疫药理作用,以明确该配伍发挥抗肿瘤作用的部分药理机制。

1 材料

1.1 实验动物与药物SPF级雌性6～7周龄C57BL/6小鼠购于济南朋悦实验动物繁育有限公司;桔梗(PlatycodonGrandiflorum, PG)、姜半夏(PinelliaTernata, PT)药材均购于山东建联盛嘉中药有限公司。

1.2 主要试剂与仪器Fc阻断剂、流式抗体(美国BD公司),TRIzon Reagent、RNase Inhibitor、dNTP (北京康为世纪有限公司),RevertAid Reverse TranscriPtase (美国Thermo Scientific公司),SYBR® Green master (美国Bio-Rad公司),浓缩煎药机(东华原医疗设备有限责任公司),FACS Aria Ⅲ流式细胞仪(美国BD公司),PCR扩增仪(德国Biometra公司),荧光定量PCR仪(瑞士罗氏诊断产品有限公司)。

2 方法

2.1 PG+PT提取液制备PG+PT按照《圣济总录》桔梗半夏汤所载1 ∶1配比,各取250 g,冷水浸泡4 ℃过夜,2次煎煮,所得水煎液经醇沉、回收、浓缩,得PG+PT提取液。

2.2 动物模型构建、分组处理方法

2.2.1正常动物灌胃分组处理 小鼠随机分为对照组(CTRL)、PG+PT提取液灌胃组(PG+PT),每组5只,PG+PT组灌胃给药,剂量为1.3 g·kg-1·d-1、约0.2 mL,连续10 d。

2.2.2B16黑色素瘤肺脏转移模型构建及分组处理 小鼠随机分为正常对照组(CTRL)、B16黑色素瘤肺脏转移模型组(B16)、肿瘤模型PG+PT治疗组(B16-PG+PT),每组5只,B16组、B16-PG+PT组尾静脉注射B16黑色素瘤细胞(2×105/只)构建肿瘤肺脏转移模型,造模前3 d起,B16-PG+PT组灌胃给药,剂量为1.3 g·kg-1·d-1、约0.2 mL,连续17 d。

2.3 流式细胞术取小鼠肺脏,制备单细胞悬液,去除红细胞,进行细胞计数,每个样本取1×106个细胞,Fc阻断剂阻断细胞表面非特异性结合,加入外标抗体,4 ℃避光孵育1 h,流式细胞仪检测肺脏NK细胞及其CXCR3表达。

2.4 RT-qPCR取小鼠肺脏,提取肺组织总RNA,进行RNA反转、合成cDNA,以cDNA为模板,进行qPCR,以GAPDH为内参,2-ΔΔCt计算CXCL9相对表达量。

2.5 10×Genomics单细胞测序取小鼠肺脏,制备单细胞悬液,检测细胞活性,构建cDNA文库,区分目标序列的样品来源,Cell Ranger软件进行数据质量统计,采用SingleR包基于immgen参考数据集进行细胞类型注释,Seurat软件包筛选差异基因、进行富集分析,结果使用Loupe Brower进行分析。

3 结果

3.1 PG+PT促进小鼠NK细胞在肺脏的募集与CTRL组对比,PG+PT组小鼠肺脏CD45+淋巴细胞的比例(P<0.01)和数量(P<0.05)均明显升高,其中NK细胞比例(P<0.05)上升尤为突出。

3.2 PG+PT促进小鼠CXCR3+NK细胞在肺脏募集与CTRL组对比,PG+PT组CXCR3+NK细胞比例(P<0.001)和数量(P<0.01)明显升高,肺组织中趋化因子CXCL9的基因表达水平明显上升(P<0.01)。

3.3 PG+PT抑制小鼠B16黑色素瘤肺脏转移与CTRL组对比,B16组肿瘤肺脏转移灶明显;与B16模型组对比,PG+PT处理组肺脏肿瘤克隆数明显减少(P<0.01)。

3.4 PG+PT促进小鼠肺脏肿瘤微环境中NK细胞募集与CTRL组对比,B16组肺脏CD45+淋巴细胞比例下降(P<0.01),PG+PT提取液治疗后CD45+淋巴细胞比明显上升(P<0.05),且B16-PG+PT组NK细胞的比例明显高于B16组(P<0.05)。

3.5 PG+PT提高小鼠肺脏肿瘤微环境中NK细胞的杀伤能力与CTRL组对比,B16组的NK细胞数量明显降低(476vs653),并且低表达IFN-γ、穿孔素等抗肿瘤效应因子;与B16组对比,B16-PG+PT组NK细胞数增多(521vs476),上调IFN-γ和穿孔素的基因表达。

3.6 PG+PT促进小鼠CXCR3+NK细胞在肺脏肿瘤微环境中的募集与CTRL组对比,B16组小鼠肺脏肿瘤微环境中CXCL9基因表达水平降低,B16-PG+PT组肺组织CXCL9基因表达水平明显升高。与B16组对比,B16-PG+PT组CXCR3+NK细胞比例和数量均明显上调(P<0.05)。

4 讨论

NK细胞通过分泌IFN-γ[6]、穿孔素[7]等发挥抗肿瘤作用,其中CXCR3+NK细胞对比CXCR3-NK细胞具有增殖能力强、快速大量产生IFN-γ的特点[8],并受组织微环境中CXCL9/10的招募[2]。

本研究发现,PG+PT能够抑制B16黑色素瘤肺脏转移,在生理状态下和肿瘤微环境中均可上调肺组织CXCL9的表达,优势招募CXCR3+NK淋巴细胞在肺脏募集,在肿瘤微环境中促进NK细胞分泌IFN-γ、穿孔素等抗肿瘤因子,为NK细胞的肿瘤防治提供了免疫辅助治疗的可能性。