雏鸡脂肪肝冰冻切片制作过程中苏丹III染色条件的探索

赵慧超,李争博,张佳乐,刘艳,韩展鹏,徐之勇

（1.河南科技学院动物科技学院,河南 新乡 453003；2.中国人民解放军陆军第八十三集团军医院，河南 新乡 453000）

脂肪肝是由营养过剩、药物损伤、高血脂等多种原因引起的以肝细胞弥漫性脂肪变性（即肝细胞内脂肪堆积过多）为特征的营养代谢性疾病,在我国较为常见.目前,脂肪肝在正常人群中患病率接近30%；在肥胖、代谢障碍且确诊2 型糖尿病的患者中,脂肪肝的患病率超过50%.2 型糖尿病患者非乙醇溶液性脂肪肝发病率高达69.5%,且随年龄增长而增长.轻度脂肪肝无明显症状；中、重度脂肪肝会出现慢性肝炎的症状,且可能导致肝病残疾和死亡.另外,脂肪肝还能导致机体消化功能紊乱、免疫力降低和解毒功能减弱.在养殖业如养鸡业中,产蛋母鸡高发脂肪肝.蛋鸡发生脂肪肝的原因有很多,例如鸡采食的饲料中营养物质过剩引起脂肪肝；饲料中氯化胆碱、VE、VB12、蛋氨酸等营养素的缺乏导致脂肪肝；各种病毒性疾病、肝胆疾病及中毒等因素使肝脏受到损伤而形成脂肪肝.虽多数蛋鸡眼观体况良好,却会出现突然死亡的情况.死亡的蛋鸡腹腔及皮下蓄积了大量脂肪,且肝被膜下有血凝块出现.脂肪肝可通过临床诊断,一般认为通过CT 或MRI 检测体内转氨酶水平及腹部肝脏脂肪状况判断[1],也可通过试验室诊断,如心血涂片和肝组织苏丹III 及油红O 染色来确诊[2].确诊后可通过调整饲料配方,降低能量饲料等来预防脂肪肝的发生[3].由于脂肪肝的发病机制尚未完全明确,且缺乏有效治疗方法,只能以预防为主,因此快速检测出脂肪肝并采取相应预防措施对提高养殖业的经济效益具有重要意义.

冰冻切片技术是通过低温将组织材料冻结变硬后进行切片的一种试验技术,在病理临床中应用广泛.冰冻切片比石蜡切片少了脱水、透明、浸蜡等步骤,因此可以方便快捷地得到结果,并且组织不会收缩变形.在制作石蜡切片并进行HE 染色的过程中,肝组织中的脂质被二甲苯及乙醇溶液溶解,显微镜下可看到肝细胞中出现界限清楚的圆形脂肪空泡.但是,当肝细胞出现气球样变性时,HE 染色时出现的圆形空泡不能确定其为脂肪溶解留下的,还是气球样变性导致的.因此,制作不需要乙醇溶液梯度脱水且不需要二甲苯透明的肝组织冰冻切片并进行苏丹III 染色对两者的鉴别具有一定意义.本试验采用苏丹III染色冰冻切片的方法,对雏鸡脂肪肝冰冻切片的制作方法及苏丹III 染色的最佳时间进行了研究,冰冻切片标本制作迅速,苏丹III 染色时间较短,为快速检测脂肪肝、降低鸡群死亡率、提高养殖户的经济效益打下基础,对探索养殖业中脂肪肝类营养代谢病的快速检测等方法提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验动物

1 日龄、健康SPF 雏鸡12 只,雌雄兼用,由河南科技学院SPF 动物房提供.

1.2 主要试剂的配制

甲醛溶液、蒸馏水、苏丹III 固体、乙醇溶液,均由河南科技学院实验室提供.

1.2.1 4%甲醛溶液的配制将40 mL 40%的甲醛溶液（福尔马林）与360 mL 蒸馏水混合,配制成400 mL 4%的甲醛溶液（即10%的福尔马林）.

1.2.2 苏丹III 染色液的配制使用分析天平称取0.1 g 苏丹III 固体,85 ℃加热溶解于50 mL70%的乙醇溶液中,在溶液尚未冷却时用滤纸过滤,静置6 h 后使用滤纸再过滤一遍,配制成苏丹III 染色液.

1.3 主要仪器

冷冻切片机、光学显微镜,均由奥林巴斯（中国）有限公司提供.

1.4 试验方法

1.4.1 试验动物分组与饲喂将12 只刚出生的1 日龄雏鸡随机分为对照组和试验组,每组各6 只.试验组采用不禁水、先禁食3 d 再饲喂2 d 的饲喂方法[4],对照组正常饮水及饲喂.

1.4.2 取材与固定第7 天时取材,将刚取出的肝组织浸于4%的甲醛溶液中固定2 d.

1.4.3 制作肝组织冰冻切片将冰冻切片机打开后-30 ℃预冷1 h,同时将4%甲醛溶液固定的肝组织用流水冲洗1 h.提前将刀片、镊子等将要使用的器械放进冰冻切片机冷冻,使用时更方便,且能有效减少切片卷片.切片时将冰冻切片机的温度调至-20～-18 ℃,同时将肝组织切成平整的块状,置于冷冻托上,使用OCT 冷冻包埋剂包裹组织.冷冻完成后,将肝组织切成6～10 μm 厚的片状,用镊子或短毛刷贴到载玻片上,放进-24 ℃冰箱保存.

1.4.4 苏丹III 染色将贴了肝组织切片的载玻片用蒸馏水稍微湿润后,放入提前配制好的苏丹III 染色液中浸染,在其他操作步骤相同的前提下,只改变苏丹III 浸染时间,观察切片染色效果.染色过程中用保鲜膜密封,防止苏丹III 染色液挥发.用70%的乙醇溶液将载玻片上残留的染色液冲洗干净,同时改变冲洗次数观察对染色结果的影响.将冲洗干净的载玻片放入苏木素中浸染1 min[5],同时观察使用自来水蓝化和不使用自来水蓝化对染色结果的影响.将切片用自来水冲洗干净并用甘油明胶封片,在显微镜下观察.

2 结果与分析

2.1 临床观察

由于禁食,试验组雏鸡第1、2、3 天精神沉郁,饮水量较对照组明显增多,第3 天时有个别雏鸡死亡,恢复饲喂后,即4～7 d 时雏鸡精神状态逐渐恢复.对照组雏鸡,1～7 d 精神状态良好,采食量和饮水量正常.

2.2 浸染苏丹ⅠⅠⅠ不同时间对雏鸡肝组织冰冻切片染色效果的影响

雏鸡肝组织冰冻切片浸染时间不同,染色结果就不同,具体见图1.由图1 可知,试验组雏鸡肝组织冰冻切片用苏丹III 染色液浸染5 min 后,在高倍镜下,可见肝组织内有一些淡黄色的圆形脂滴（见图1-a）散在分布,但脂滴颜色浅且不清晰,并没有呈现出理论中的橘红色,提示染色时间不足；浸染9 min 后,可见肝组织内有很多橘红色近似圆形的脂滴（见图1-b）在蓝色的细胞核周围聚集,相对浸染5 min 时,脂滴颜色更深,更为清晰；浸染30 min 后,可见肝组织内有许多橘红色的圆形脂滴（见图1-c）,此时,在细胞和组织间隙内出现了大量多余染料颗粒,提示染色时间过长.相对浸染5 min 和30 min,浸染9 min 时染色效果最好,橘红色脂滴明显,肝组织间隙无多余染料残留,便于观察.

图1 试验组雏鸡肝组织冰冻切片浸染不同时间的染色结果（苏丹III,400 X）Fig.1 Staining results of frozen sections of chicken liver tissue in experimental group for different time（Sudan III,400 X）

2.3 冲洗不同次数对雏鸡肝组织冰冻切片染色效果的影响

将浸染过苏丹III 染色液9 min 的肝组织用70%乙醇溶液冲洗2 次后,在高倍镜下可见肝组织内有很多橘红色的圆形脂滴,且肝细胞间隙中有很多淡黄色且无固定形状的非脂滴存在,具体见图2-a,提示苏丹III 染色液没有冲洗干净,肝细胞间隙中还存在大量残留的染料颗粒；冲洗9 次后,肝细胞间隙干净无杂质,但肝组织内近似圆形的橘红色脂滴数量明显减少,且颜色减淡为浅黄色,甚至近乎透明（见图2-c）,提示冲洗次数过多,本身的脂滴颜色被乙醇溶液溶掉；冲洗5 次后,可见肝组织内有许多橘红色的圆形脂滴,且肝细胞间隙中的淡黄色物质明显减少（见图2-b）,相对冲洗2 次和9 次,冲洗5 次后肝组织中的脂滴更加清晰,且无多余染料混淆结果,容易辨别.

图2 试验组雏鸡肝组织冰冻切片冲洗不同次数的染色结果（苏丹III,400 X）Fig.2 staining results of frozen sections of chicken liver tissue washed for different times in experimental group（Sudan III,400 X）

2.4 苏木素蓝化时间对雏鸡肝组织冰冻切片染色效果的影响

试验组雏鸡肝组织冰冻切片苏木素的染色结果如图3 所示.

图3 试验组雏鸡肝组织冰冻切片苏木素未蓝化和蓝化的染色结果（苏丹III,200 X）Fig.3 results of hematoxylin staining in frozen sections of liver tissues of chickens in experimental group（Sudan III,400 X）

由图3 可知,将浸染过苏木精的切片放入自来水中蓝化3 min 后,在高倍镜下可见肝细胞的细胞核呈蓝色,且肝组织中有很多橘红色的圆形脂滴（见图3-b）.蓝色和橘红色是互补色,因此,在蓝色细胞核的对比之下,橘红色的脂滴清晰可见.而只浸染了苏木素,未进行蓝化操作的切片,肝细胞的细胞核呈紫色.肝组织中的橘红色圆形脂滴由于和紫色的细胞核颜色接近,相对影响结果的观察（见图3-a）.相对于不蓝化,进行蓝化操作更有利于观察脂滴的数量,提高观察效果.

2.5 对照组和试验组雏鸡肝组织冰冻切片

对照组和试验组雏鸡肝组织冰冻切片的染色结果如图4 所示.

图4 对照组和试验组雏鸡肝组织冰冻切片的染色结果（苏丹III,400 X）Fig.4 Staining results of frozen sections of chicken liver tissue in control group and experimental group（Sudan III,400 X）

由图4 可知,对照组雏鸡的肝细胞中空泡较少,无明显的橘红色脂肪滴（见图4-a）,说明对照组雏鸡的肝组织中脂肪含量相对较少,而试验组雏鸡肝组织内有大量橘红色的圆形脂滴（见图4-b）,说明试验组雏鸡的肝细胞中存在大量脂肪.

3 讨论

肝脏是机体内许多生理过程的关键枢纽,大量营养物质在肝脏内的加工、分配和代谢为生物体新陈代谢、免疫系统、激素分泌、油脂代谢、血糖水平平衡及内环境稳定提供了能量,因此,肝脏也是维持机体正常生命活动的重要器官[6].据统计,肥胖人群中有一半患有NAFLD[7],由肥胖引起的高血压可能是由于肾素- 血管紧张素醛固酮系统的拮抗作用从而引发全身性高血压并伴有NASH 和肝硬化[8].研究结果普遍认为NAFL 和NASH 的发病原因是因为肝脏处理主要代谢能量底物、糖类和脂肪酸的量超负荷,导致有毒脂质在肝脏中积累[9],从而引起肝细胞应激、损伤、死亡,继而出现肝纤维化和基因组混乱,极大地提高肝硬化和肝癌的患病率[10].研究表明,一些基因可以提高NASH 的患病率[11],如PNPLA3 基因的主要作用是调控肝细胞脂滴的脂解,同时也是与NASH 息息相关的关键基因[12].甘油三酯可以作为VLDL 进入血液中或储存在脂滴中,脂滴中的甘油三酯通过调节性脂肪分解,将脂肪酸释放肝细胞游离脂肪酸库,正是PNPLA3 参与这一脂解过程.当脂肪酸通过β- 氧化或者转化为甘油三酯时,由于累积的脂肪酸较多而导致肝细胞严重负载,因此脂毒性物质大量生成,从而引发ER 应激,氧化应激和炎性小体活化,同时伴有肝细胞损伤、炎症、星状细胞活化和细胞外基质的大量积累,此过程即为NASH 的临床表现.

本试验采用先禁食再饲喂的方法使雏鸡肝脏中的脂肪含量增加[4].研究表明,禁食会显著降低鸡肝的脂肪生成水平,而重新喂食可以在1 小时内恢复降低的脂肪生成容量[13].

在本试验中发现,制作的雏鸡肝组织冰冻切片用苏丹III 浸染5 min 时虽然也有深黄色的圆形脂滴,但颜色还未达到理论上的橘红色,即提示染色时间不足,同时不确定是否仍有脂滴未染上颜色；用苏丹III浸染9 min 时,橘红色脂滴较为清晰、明显,时间最佳；用苏丹III 浸染30 min 与浸染9 min 时的效果没有显著差异,因此浸染时间不需要过长.这与杨艳[14]等试验中用苏丹III 浸染9 min 就呈现出橘红色脂滴的结果一致.

在本试验中还发现,同一试验组的雏鸡肝组织冰冻切片浸染过苏丹III 染色液后,用70%的乙醇溶液冲洗次数不同,呈现出的染色效果也不同.具体表现为：用70%乙醇溶液冲洗2 次,肝组织内的橘红色脂滴明显、数量多,但是肝细胞间隙会存在一些不确定是脂肪还是苏丹III 染色液残留的淡黄色物质,不确定是脂肪被苏丹III 染上了颜色还是由于70%乙醇溶液冲洗不干净而残留的苏丹III 染色液；用70%乙醇溶液冲洗9 次,肝组织内的脂滴呈现为浅黄近乎透明的颜色,肝细胞间隙的不明淡黄色物质消失,怀疑是70%乙醇溶液溶解了部分脂肪,且将苏丹III 染色液稀释了,染色效果不佳,不方便与对照组观察对比；用70%乙醇溶液冲洗5 次时肝组织内的橘红色脂滴清晰明显,肝细胞内的脂滴数量并未减少,但肝细胞间隙中存在的淡黄色不明物质明显减少.这与杨艳[14]等试验中提到的在染色过程中脂肪溶于乙醇溶液而导致苏丹III 染色效果不佳,不能呈现出橘红色的结论相似.

本试验中,对染色后的雏鸡肝组织冰冻切片采取蓝化措施后,紫色的细胞核变成蓝色.在色环中,紫色和橘红色距离较近,而蓝色和橘红色为互补色[15].因此紫色的细胞核有些影响观察橘红色脂滴的数量,而蓝色的细胞核凸显了橘红色的脂滴,有利于观察脂滴的数量,改善观察效果.本研究结果显示,将肝组织冰冻切片标本用苏丹III 浸染9 min、70%乙醇溶液冲洗5 次、苏木素浸染1 min、在自来水中蓝化3 min 的时候,肝组织的脂肪部位被明显染成橘红色,组织间隙不明争议性物质明显减少,染色效果最好,可快速有效检测出脂肪肝.油红O 染色也可鉴别脂滴和气球样变性,油红O 染色程序大约需要18 min[16],而本试验使用苏丹III 染色程序大约需要15 min,故此方法针对快速检测脂肪肝有积极影响,也为蛋鸡饲养过程中快速诊断脂肪肝提供了理论依据.

4 结论

脂肪肝对临床和畜牧行业的影响不言而喻,但是由于缺乏有效治疗脂肪肝的方法,只能以预防为主,因此利用冰冻切片并进行苏丹III 染色,对脂肪肝进行快速检测诊断并采取相应预防措施,对提高养殖业的经济效益具有重要意义.本试验中,将肝组织冰冻切片标本用苏丹III 浸染9 min、70%乙醇溶液冲洗5 次、苏木素浸染1 min、在自来水中蓝化3 min 时,肝组织染色效果最好,这为快速有效检测脂肪肝以降低鸡群死亡率、提高养殖户的经济效益打下基础,对养殖业快速检测脂肪肝类营养代谢病提供参考.