基于SSR 标记构建江西杉木核心种质及其分子身份证

娄永峰，朱柯帆，宋晓琛，冷春晖，陈兴彬，肖复明＊

(1.江西省林业科学院，江西省植物生物技术重点实验室，江西 南昌 330032；2.信丰县林木良种场，江西 信丰 341602)

林以种为本，种以质为先。林木种质资源是林业种业发展的基础，是林业生产力发展的基础性资源和国家战略性资源，随着中国林业种业创新力度的不断加大，愈发重视各类林木种质资源的保护和利用[1]。然而数量庞大的种质资源会影响种质的保存、评价和利用，特别是多年生林木种质，其树体高大、个体占地面积广、管理成本高，不便于种质资源的有效管理和深入研究[2-4]。因此，Frankel 和Brown 等提出并逐步发展了核心种质的概念，即运用一定的策略选取最小的种质资源数量以最大程度地代表种质资源的遗传多样性[5-6]。核心种质的构建主要基于表型性状[7-8]或基于分子标记[9-11]。对于树体高大、多年生林木来说，以DNA 多态性为基础的分子标记不易受林木生长期和环境的影响，较表型性状更适合其核心种质的构建[3,12]。目前利用分子标记的方法已在杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)[2]、核桃(Juglans sigillataDote)[3]、杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook)[4,13]、毛白杨(Populus tomentosaCarr.)[10]、美洲黑杨(P.deltoidesMarsh.)[14]、板栗(Castanea mollissimaBl.)[15]、 木 荷(Schima superbaGardn.et Champ.)[16]、红锥(Castanopsis hystrixMiq.)[17]、刺槐(Robinia pseudoacaciaL.)[18]等林木上建立了核心种质。

杉木是我国重要的乡土针叶用材树种，主要分布于我国长江流域、秦岭以南地区。20 世纪70 年代起，江西省开始收集保存杉木优树种质，建立来源丰富的种质资源库，进行遗传改良工作[19]。持续的种质资源收集为杉木种质创新和遗传改良提供了丰富的材料，但日益剧增的种质资源数量不利于种质资源的保存、评价、创新研究及开发利用[4,19]。因此江西杉木核心种质的构建对充分利用现有江西杉木种质资源具有重要意义。同时目前的杉木种质资源收集、保存中由于缺乏统一、规范的编目工作等，导致存在本底不清，重复收集保存等问题[20]，故开展种质鉴定、分子身份证构建等工作对杉木种质资源的收集、保存和利用十分重要。本研究通过SSR 标记分析现有的江西杉木种质资源遗传多样性，构建核心种质，并根据SSR 分子指纹图谱、种质资源信息等绘制核心种质分子身份证，为今后江西杉木种质资源的研究与利用提供理论依据和核心材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自江西省安福县陈山林场和信丰县林木良种场国家级杉木良种基地种质资源库，包括江西地方特色杉木优良种源-安福陈山红心杉优树种质群体(安福群体，AF)、赣南地区杉木优树种质群体(赣州群体，GZ)和江西本省其他地区杉木优树种质群体(其他群体，QT)。其中安福陈山红心杉种质群体165 份，其主要来自罗霄山脉陈山林区；赣南地区杉木优树种质群体224 份，其主要来自江西南部赣州全南、龙南、信丰等地；江西本省其他地区杉木优树种质群体106 份，其主要来自江西铜鼓、吉安、上饶、景德镇等地。参试495 份材料均为优树无性系材料。

2021 年4 月，采集健康且无病虫害的新叶，冰袋保存带回实验室放置-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.2 DNA 提取与SSR 分析

采用改良CTAB 法提取杉木新叶DNA，在完成质量及浓度检测后，定量至约30.0 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。

基于文献检索及课题组前期的杉木SSR 引物开发，最终筛选了20 对SSR 引物用于后续分析[19]。SSR 引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，在每对引物的正向引物5′端进行M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′) 修饰，然后合成3′端具有荧光的M13 接头(FAM、HEX)，通过序列互补进行标记。SSR-PCR 体系(20.0 μL)：DNA 模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2 × Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 7 min。荧光引物扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行分析。

1.3 数据分析

1.3.1 遗传多样性评价 运用PopGene 32 软件开展遗传多样性分析，主要参数包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s 遗传多样性指数(H) 和Shannon’s 信息指数(I) 等，利用PICCalc 软件计算SSR 标记的多态信息含量(PIC)。通过Ntsys 软件采用UPGMA 进行聚类分析，构建树状图。

1.3.2 核心种质构建及评价 利用Core finder 软件[21]，以等位基因数最大化(M 策略) 为原则对SSR 数据进行分析，从供试江西杉木材料中抽取核心种质。核心种质构建完成后，对构建的核心种质的相关遗传参数进行t检验来评价核心种质的代表性。同时通过主坐标分析(PCoA)对构建的核心种质进行确认。

1.3.3 核心种质分子身份证构建 依据SSR 标记PIC值的高低，依次增加标记数量进行核心种质的UPGMA 聚类分析，筛选能实现所有核心种质有效区分所需的最少SSR 标记组合，以这组SSR 标记作为高效标记组，用于后续核心种质SSR 分子指纹图谱和分子身份证的构建。将高效SSR 标记组在核心种质中检测到等位基因，按小到大的顺序排序，然后用数字1～9 进行编码，若等位基因数大于9 时，则用A～Z 编码，缺失位点用0 表示，构建每个核心种质的SSR 分子指纹图谱。将种质信息和SSR 分子指纹图谱相结合，分别利用条码生成器和二维码生成器构建江西杉木核心种质的分子身份证。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

利用SSR 标记对江西杉木种质进行分析以探究其遗传多样性，结果发现(表1)：20 个SSR 标记在495 份江西杉木种质中共检测到等位基因数(Na)122 个，平均为6.1 个位点，其中CLSSR33标记最少，仅有2 个，CLSSR9 标记最多，达15 个。所选择的20 个标记中，获得等位基因数(Na)在5 个以上的标记有16 个，表明本研究选择的SSR 标记位点多态性较好，可用于江西杉木种质的遗传多样性分析。此外，20 个标记位点的有效等位基因数(Ne) 变化范围在1.014～3.405 之间，平均值为1.836；Shannon’s 信息指数(I)变化范围为0.045～1.428，平均值为0.762；Nei’s遗传多样性指数(H) 变化范围在0.014～0.706 之间，平均值为0.400；观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He) 均值分别为0.394 和0.400，Ho＜He；位点多态性信息含量(PIC) 的变化范围为0.014～0.657，平均值为0.357，其中低度多态性位点6 个(PIC≤0.25)；中度多态性位点11 个(0.25＜PIC＜0.5)；高度多态性位点3 个(PIC≥0.5)。以上结果表明495 份江西杉木种质的遗传多样性较丰富。

表1 江西杉木495 份种质遗传多样性参数Table 1 The genetic diversity parameters of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

2.2 核心种质构建与评价

利用Core Finder 软件，采用M 策略进行抽样构建核心种质，结果表明当抽取种质数量为52 份时，等位基因保留比例接近100%。因此，基于SSR 基因型数据从495 份江西杉木种质中抽取52 份核心种质，抽样比例为10.5%，其中安福陈山红心杉种质10 份，赣南地区种质20 份，江西其他地区的种质22 份。

通过遗传多样性参数分析对构建的江西杉木52 份核心种质的代表性进行评价，结果表明(表2)，与原种质比较，核心种质的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s 信息指数(I)、Nei’s 遗传多样性指数(H)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He) 和多态信息含量(PIC) 的保留比例依次为100.0%、107.4%、115.1%、109.0%、104.1%、110.0% 和111.2%，且t检验显示核心种质与原种质间各遗传多样性参数差异不显著，说明构建的核心种质很好的保留了原种质的遗传多样性，因此初步认为52 份核心种质能够代表495 份原种质。PCoA 对核心种质作进一步确认，结果显示，江西杉木52 份核心种质较为均匀地分布在495 份原种质中(图1)，说明构建的核心种质具有较好的代表性。

图1 江西杉木核心种质PCoA 分析Fig.1 The principal coordinates analysis of core collection of C.lanceolata germplasms from Jiangxi

基于聚类分析52 份核心种质可分为6 大类。其中，核心种质QT065、QT099 和GZ012 均单独形成一类；核心种质GZ051 和GZ209 则形成一类，QT059 和QT063 组成一类；其余45 份核心种质则形成一大类。

2.3 核心种质分子身份证构建

由于杉木为二倍体，每个SSR 位点应由2 个相同或不同的等位基因组成。SSR 标记的等位基因数、基因型越多，PIC值越高，能区分种质的能力也越强，在绘制指纹图谱中价值也越高。基于最少标记区分最多种质的原则，依据SSR 标记的PIC值的高低，依次增加标记数量对核心种质进行区分，结合UPGMA 聚类，结果发现H97 标记与H286、CLSSR9 和CLSSR37 相结合，就可将52 份江西杉木核心种质完全鉴别区分(图2)。

图2 基于UPGMA 聚类的江西杉木核心种质鉴别分析Fig.2 The identification of core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi by UPGMA

通过H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 这4 个高效SSR 标记在52 份核心种质中检测到的等位基因，构建每份核心种质的SSR 分子指纹图谱(图3)。将获得SSR 分子指纹图谱数据与种质信息编码一同构建核心种质特异的分子身份证码。参考王华缄等[20]，种质信息编码共有6 位数字组成，分为3 个部分，第1～3 位表示种质原产地信息，如001 为江西省安福县；第4 位是种质资源类别，1 表示一代优树，2 表示二代优树、3 表示三代优树等；第5～6 位表示收集、保存时间，如79 表示1979 年。若上述信息未知或不清楚则用X 表示。以AF047 为例（图4），其分子身份证号码为00110668444B34，表示该种质原产地江西省安福县，收集、保存的为1 代优树，时间为2006年，4 个核心标记（H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37）的指纹图谱依次为68/44/4B/34。最后利用每份种质的14 位分子身份证编号，分别制作条形码和二维码（图4）。

图3 江西杉木核心种质的SSR 分子指纹图谱Fig.3 The DNA fingerprint of the core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

图4 部分江西杉木核心种质的DNA 分子身份证Fig.4 The DNA molecular IDs of some core collection of the C.lanceolata germplasms from Jiangxi

3 讨论

进行遗传多样性评价是开展种质资源评价工作的重要组成部分。开展杉木种质资源的遗传多样性研究对收集、保存、评价和利用杉木种质材料的意义重大。江西是我国杉木的主要的分布和中心产区之一，栽培历史悠久，在长期的自然选择和人工选择作用下形成一些颇具特色的优良种质资源，如安福“陈山红心杉”、武宁“瓜源木”、遂川“龙泉木”、全南“黄田江杉木”等[22]，使得江西拥有丰富的杉木种质资源。本研究采用20 个SSR 标记在495 份江西杉木种质中共检测到122 个等位基因(Na)，平均Shannon’s 信息指数(I)、平均Nei’s 遗传多样性指数(H)、平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.762、0.400、0.394 和0.400，与其他采用相同技术进行的杉木相关研究结果比较[4,13,23-24]，江西杉木种质资源具有较丰富的遗传多样性。

在林木育种中，核心种质在亲本选择、杂交育种、种质保存和利用等方面发挥着重要作用。核心种质是通过从整个种质资源中选择出少量且具有代表性的种质材料，可以最大程度的代表原种质的遗传多样性水平。因此，在构建核心种质中应优先考虑选择稀有位点，最大限度保留原种质的等位基因多样性[4,25]。M 策略基于等位基因的最大化，同时兼顾遗传多样性，是目前最具优势的一种方法。通过Core Finder 软件以M 策略构建核心种质已在杜仲、杉木、木荷等林木上成功应用[2,4,16]。因此，本研究选择基于M 策略利用Core Finder 软件构建江西杉木种质资源的核心种质，结果从495 份江西杉木原种质中得到52 份核心种质，同时通过t检验和PCoA 分析，显示获得的核心种质具有更丰富的遗传多样性，且均匀分布于原种质资源中，表明构建的核心种质可靠有效，具有代表性。

核心种质构建的宗旨是以最小的资源数量和遗传重复包含原种质中最大的遗传多样性。因此，确定合理取样比例是关键[9]。目前研究表明林木种质资源的核心种质取样比例一般在10%～30%之间。方乐成等[26]分析了192 份楸树(Catalpa bungeiC.)种质的遗传多样性，获得了46 份核心种质，抽样比例23.96%；刘松等[15]利用SSR 标记建立了占原种质24.85%的中国板栗核心种质；杨汉波等[16]基于SSR 标记从754 份木荷种质资源中获得了115 份核心种质，占原种质的15.3%；李洪果等[2]则从887 份杜仲种质中得到189 份核心种质和698 份保留种质，核心种质占原种质的21.3%。在本研究中，根据SSR 标记分析结果，基于M 策略从495 份原种质中抽取了52 份核心种质，经过遗传多样性评价和显著性t检验，确定江西杉木核心种质合适的取样比例为10.5%。这个比例与已报道的同样基于SSR 标记获得的广西杉木核心种质占比9.3%接近[4]；低于Duan 等[13]从南方6 个省份700 份杉木基础群体中构建300 份核心种质的比例，也低于在SNP 标记基础上获得杉木核心育种群体占比(64.7%)以及速生优质杉木核心种质占比(50%)[27-28]。本研究的杉木种质均来源江西省，李魁鹏等[4]杉木种质则主要来源广西境内，两者的遗传结构较Duan 等[13]700 份杉木材料来源南方6 省市相对简单。这符合核心种质的取样比例应根据原种质资源的遗传结构和数量规模来决定[29]。江西杉木52 份核心种质中安福陈山红心杉种质10 份(6.1%)、赣南地区种质20 份(8.9%)、江西其他地区的种质22 份(20.8%)，安福陈山红心杉种质资源较多，但抽取的核心种质反而较少，这可能与陈山红心杉种质资源遗传多样性水平偏低有关[19]。

本研究中，52 份核心种质的等位基因数(Na)的保留比例为100%，而有效等位基因数(Ne)、Shannon’s 信息指数(I)、Nei’s 遗传多样性指数(H)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC) 6 个参数的保留比例大于100%，这主要是由群体中的样本量和等位基因频率改变引起。这些遗传参数都是根据等位基因频率按不同的方法估算获得，用于度量不同群体在多样性上的遗传冗余情况，而核心种质的构建是一个减少频率高等位基因、增加稀有等位基因比例的过程，在去除遗传冗余的过程中，各等位基因频率的不规律增减会导致相应遗传多样性参数保留比例大于100%，这一现象在杜仲[2]、毛白杨[10]、木荷[16]和新疆野杏(Armeniaca vulgarisLam.)[25]等的核心种质构建中均存在。

随着DNA 分子指纹图谱的快速发展，SSR 等分子标记的检测结果可进一步转化为字符串、条形码或二维码，即DNA 分子身份证[30]。种质鉴定是种质资源收集、评价、保存和利用的基石，DNA分子身份证是种质鉴定的重要工具，目前已被广泛应用在作物、菌类、果树、花卉等种质鉴定[30-32]，近年来，这一技术也逐步应用于林木种质资源的鉴定[33]。胡春龙等[34]构建了46 份白蜡(Fraxinussp.)种质资源的分子身份证，为白蜡新品种的审定、DUS测试等奠定了理论基础。张成才等[35]对36 个薄壳山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch)国外引种品种建立分子身份证，为区分和鉴别薄壳山核桃品种提供参考。本研究在运用SSR 标记分析江西杉木遗传多样性的基础上，构建了其核心种质的DNA 指纹图谱，绘制了相应的分子身份证。不同于已报道的杉木分子身份证，本研究构建的分子身份证不仅包含了杉木种质的DNA 指纹图谱信息，同时借鉴作物、果树等种质的分子身份证构建方法，设定了包含种质原产地、种质资源类别、收集保存时间的补充码，进一步增加所绘制的种质分子身份证的可靠性和特异性。

4 结论

本研究利用前期筛选的20 个杉木SSR 标记，分析了495 份江西杉木种质的遗传多样性，并利用M 策略构建了含有52 份材料的江西杉木核心种质，核心种质保留了原种质10.5%，等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s 信息指数(I)、Nei’s 遗传多样性指数(H)的保留比例依次为100.0%、107.4%、115.1%、109.0%，表明本研究建立的核心种质是有效的。同时根据标记的多态性信息含量(PIC) 和鉴别能力，确定了H97、H286、CLSSR9 和CLSSR37 等4 个标记能够实现52 份核心种质的有效区分，并构建了52 份核心种质的分子指纹图谱和分子身份证，为杉木种质资源的收集、保存和利用提供了理论基础。