益生菌在慢性创面愈合中的研究进展

林崴仪 戈成旺 唐枭伟 蔡薇 宋辉 李磊 沈干

【提要】 慢性创面发病率高，创面愈合困难，通常需要综合治疗。现有的研究发现，应用部分益生菌及其代谢产物可以抗感染、促进创面细胞增殖、调控炎症，从而促进慢性创面的愈合，证明了益生菌应用于慢性创面愈合拥有巨大潜力。本文主要就目前益生菌在促进慢性创面愈合中的使用方法，及其与各种组织细胞的相互作用进行综述，以期为慢性创面的综合治疗提供一个新的方向。

慢性创面又称慢性溃疡或慢性难愈合创面，国际上尚无统一定义。国际伤口协会将慢性创面定义为：无法通过正确有序而及时的修复过程达到解剖和功能完全修复的创面，或在没有建立持续性的解剖及功能条件下进行修复的创面，常因为压力、缺血、糖尿病、感染等原因难以愈合[1]。临床上多指由各种原因引起的接受1 个月及以上正规治疗不愈合或无愈合倾向者，通常可将慢性创面病因分为静脉性溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡、压力性溃疡、创伤性溃疡[2]。慢性创面病因复杂，愈合难度大，通常需要综合性治疗，但效果仍然不理想。如糖尿病足，高达28% 的患者需下肢截肢，接受截肢患者若无预防意识，其中的50%～80% 患者在第二年可再次出现溃疡[3-5]。

大量研究表明，在各种疾病中，肠道及皮肤益生菌微生物群发生了变化，提示益生菌及其代谢产物对人类健康促进及某些疾病变化有着积极作用[6]。益生菌具有调节免疫、减轻炎症、抑制感染等功效，应用部分益生菌可以促进慢性创面愈合，但是目前的研究有限，作用机制不明确，仍需进一步深入研究。本文就目前益生菌在促进慢性创面愈合中的使用方法，及其与各种组织细胞的相互作用进行综述，以期为慢性创面的综合治疗提供一个新的方向。

1 促进慢性创面愈合的益生菌使用方法

1.1 口服益生菌

早期研究发现，肠道疾病及某些代谢性疾病引起肠道内菌群失调，而补充足量特定的益生菌对于某些疾病有着显著的治疗作用，因肠道微生物群调节宿主生理稳态介质，包括免疫系统、肠道屏障功能和疾病易感性途径[7]。烧伤导致肠道内微生物菌群失调，产丁酸盐菌属及乳酸菌丰度明显下降，而机会致病菌丰度明显上升[8]。将益生菌作为膳食补剂可促进慢性创面的愈合，临床上通常应用于烧伤创面的治疗中。口服益生菌调节肠道屏障功能，增强免疫，减轻炎症，降低感染率，缓解脓毒血症，有助于创面愈合和缩短康复时间[9-10]。在一项口服益生菌促进小鼠皮肤创面愈合的实验中发现，口服益生菌可减少巨噬细胞和肥大细胞浸润，减轻炎症反应，并加速局部血管生成，促进创面上皮化[11]。

对于口服益生菌促进创面愈合的机制，有研究认为可能是通过肠道-皮肤轴实现的。肠道微生物失调可以引起皮肤病变，这可能是由于肠道微生物失调引起全身免疫发生变化，调节全身炎症反应，最终影响到皮肤免疫。例如，口服发酵乳杆菌可增强T 淋巴细胞增殖能力，加强巨噬细胞吞噬作用，刺激髓系树突状细胞成熟的能力等，从而提高全身免疫[12]。肠道菌群失调与某些皮肤炎性病变，如银屑病、特应性皮炎等，有着密不可分的联系[13]，炎症性肠病表现出的皮肤病变也佐证了肠道菌群可以影响皮肤这一点[14]。有研究进一步提出，肠道益生菌的皮肤效应是通过肠道-脑-皮肤轴得以实现的，即口服益生菌促进了脑内某种神经活性物质的分泌，并最终反馈到皮肤组织。例如，口服罗伊氏乳杆菌后，通过激活迷走神经通路上调了催产素的表达，激活宿主CD4+Foxp3+CD25+免疫T 调节细胞，使得小鼠背部创面愈合时间仅为对照组的一半[15]。

1.2 局部应用益生菌及其代谢产物

口服益生菌虽对慢性创面恢复具有一定疗效，但慢性创面的治疗仍然以局部护理为主。有研究尝试将益生菌及益生菌产物局部应用于创面，发现对慢性创面的愈合具有促进效果，但相关的临床研究尚处于初始阶段。

在早期的一项临床试验中，Peral 等[16]将植物乳杆菌用于感染性Ⅱ度、Ⅲ度烧伤创面，与传统的杀菌剂、磺胺嘧啶银比较，其在抑制细菌载量、提供肉芽组织创面床方面有着更加优秀的效果。近期，一项小型的糖尿病足溃疡临床实验中，将植物乳杆菌局部给药作为手术清创的辅助手段，益生菌表现出显著的抗感染能力，可促进纤维增加、血管生成，并促进巨噬细胞从促炎型M1（CD68）到抗炎型M2（CD163）表型极化，加强了中性粒细胞的吞噬作用，从而加速创面愈合[17]。在另一项下肢静脉溃疡的临床研究中，植物乳杆菌通过抑制中性粒细胞产生的炎症因子白细胞介素8（IL-8），改善局部炎症，促进静脉溃疡愈合[18]。一项治疗口腔复发性阿弗他溃疡的临床研究发现，将含植物乳杆菌的芦荟发酵凝胶涂抹于患者溃疡部位，可以加速溃疡的愈合；同时，使用DNA 提取及高通量测序发现，含植物乳杆菌的芦荟发酵凝胶可以使口腔微生物更快恢复多样化[19]。

开菲尔颗粒是一种多种益生菌混合而成的益生菌复合物，通常由乳杆菌、乳链球菌、醋酸菌、酵母菌等微生物组成，局部应用可加速大鼠烧伤创面血管、胶原的生成，加速创面整体收缩[20]。唾液链球菌K12 局部应用于小鼠的由放射引起的口腔黏膜溃疡创面，可促进溃疡愈合，基底层上皮细胞密度及黏膜厚度增加，促使上皮细胞增殖，抑制细胞凋亡[21]。将干酪乳杆菌上清液局部应用于铜绿假单胞菌定植的大鼠Ⅱ度烧伤创面中，显著抑制了铜绿假单胞菌感染，效果甚至强于应用亚胺培南的阳性对照组[22]，同时增加了表皮和真皮的最大厚度[23]。在烧伤动物模型局部应用益生菌，不仅可以抑制感染，同时还可以减轻感染后的瘢痕形成。在兔的感染性烧伤模型中，植物乳杆菌不仅减轻了铜绿假单胞菌感染的严重程度，缩短了感染持续时间，同时在创面愈合后的瘢痕组织中，益生菌治疗显著减少了感染伤口中Ⅰ型胶原纤维及总胶原蛋白的积累，与未感染伤口显示出几乎同样的效果[24]。

上述研究结果表明，局部应用益生菌及其产物，对慢性创面的愈合具有极大的临床治疗潜力。

1.3 局部应用基因工程菌

除了口服益生菌补剂和局部应用益生菌发酵上清液或灭活菌株，另一种治疗策略是利用基因工程技术，将编码某种促进愈合的基因转入到益生菌中，形成基因工程菌。将基因工程活菌应用于伤口治疗，因活性益生菌活跃的新陈代谢，可持续表达某些有益物质，可以更加有效地抑制病原菌的黏附、增殖，促进慢性创面的愈合。将含有编码趋化因子CXCL12 基因的罗伊氏乳杆菌应用于小鼠创面治疗，持续产生的乳酸降低了局部pH 值，抑制了肽酶CD26，提高了CXCL12 生物活性；另外，基因工程菌产生的CXCL12 通过上调巨噬细胞TGF-β 的表达，促进真皮细胞增殖，有效促进伤口闭合[25]。另一项研究显示，同样编码CXCL12 基因的基因工程菌在猪的创面上也呈现出类似效果[26]。基因工程菌有其独有的优势，克服了单独使用益生菌产物药效不能持久、需要多次给药的缺点，证明了基因工程菌应用于慢性创面治疗的可行性。

2 益生菌抑制病原菌感染

创面不愈合的原因错综复杂，病原菌感染在其中具有重要的作用。大多数定植在慢性创面的病原菌属于21 个科，葡萄球菌科及假单胞菌科是慢性创面中最常见的菌属[27-28]。慢性创面上的病原菌可分泌多种毒力因子及蛋白酶，从而抑制伤口愈合[29]，同时还可形成生物膜，阻止抗生素杀灭细菌[30]。

2.1 益生菌直接抑制病原菌活力与毒力

多项研究表明，益生菌对于慢性创面常见致病菌存在显著抑制作用。益生菌能产生过氧化氢、有机酸、抗菌肽、细菌素等物质抑制病原菌。干酪乳杆菌分泌乳酸、醋酸、丁二酸、柠檬酸等有机酸抑制铜绿假单胞菌的黏附过程[23]。发酵乳杆菌产生的细菌素和胞外多糖同样抑制了铜绿假单胞菌的增殖及其生物膜的形成[31]。一种酵母提取液可以显著抑制多种金黄色葡萄球菌α-溶血素和肠毒素A 基因的表达以及生物膜的形成[32]。部分益生菌对真菌具有显著的抗菌作用，如嗜热链球菌对白假丝念珠菌具有显著抗菌活性[33]，鼠李糖乳杆菌显著抑制热带念珠菌、克鲁氏假丝酵母菌和近平假丝酵母菌等非白念珠菌[34]。

2.2 益生菌抑制群体感应

益生菌抗菌的另一种机制可能给是对于群体感应（Quorum-sensing，QS）产生抑制作用。随着细菌种群数量不断增长，细菌会产生一种自体诱导物的信号分子，当达到一定阈值时，会开启细胞密度依赖的特定基因表达，这种通信系统则为群体感应。群体感应广泛参与细菌生物膜的形成及毒力因子的产生[35]。一种由水产饲料分离出来的短乳杆菌通过下调铜绿假单胞菌LasA 和LasB 基因，调节了群体感应系统，抑制了生物膜及绿脓素的形成[36]。乳杆菌产生的另一类二酮基哌嗪类化合物，抑制了酰基高丝氨酸内脂类分子（AHLs），从而可抑制铜绿假单胞菌毒力[37]。

3 益生菌促进慢性创面组织细胞生长

创面愈合的增殖期以大量细胞生长及细胞外基质堆积为显著特点。在细胞方面，成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞在慢性创面组织增殖期中起到了关键的作用。细胞外基质主要包括蛋白多糖、透明质酸、胶原和弹力蛋白，在肉芽组织的形成中发挥重要作用。在此期间，多种细胞因子、生长因子、趋化因子广泛参与其中[38]。益生菌不仅可以保护创面细胞免受病原菌的毒害，还可以直接促进成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞的增殖和迁移，抑制细胞外基质的降解，减轻局部炎症反应，促进慢性创面组织生长，加速创面愈合。

3.1 益生菌与成纤维细胞

益生菌通过促进成纤维细胞增殖、迁移，加强胶原分泌，从而缩小创面，加速创面愈合。开菲尔颗粒与成纤维细胞共培养后，MTT 增殖实验及细胞划痕实验证明，开菲尔颗粒促进成纤维细胞增殖和迁移，且呈剂量依赖性增加。在大鼠烧伤创面中，开菲尔颗粒增加碱性成纤维生长因子（bFGF）、降低炎症因子白细胞介素-1（IL-1）表达，促进烧伤创面中的胶原形成，加速愈合[20]。在另一项实验中，从乳杆菌分离出来的胞外多糖与成纤维细胞体外共培养，能促进成纤维细胞的增殖与迁移，同时抑制弹性蛋白酶、胶原酶和基质金属蛋白酶活性，抑制细胞外基质降解[39]。罗伊氏乳杆菌上清液通过抑制炎症，促进牙龈成纤维细胞生长，其分泌的前列腺素E2（PGF-E2），可能在炎症消退中发挥重要作用[40]。

3.2 益生菌与角质形成细胞

益生菌还可以通过促进角质形成细胞增殖，来加速慢性创面的上皮化，提供上皮屏障保护。多项对角质形成细胞的体外实验证明了其优秀的保护作用。长双歧杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等，能有效促进人原代表皮角质形成细胞的增殖迁移，增强了紧密连接，降低细胞通透性，从而抵抗病原菌的入侵[41]。长双歧杆菌通过调节Toll 样受体-2（TLR-2）加强紧密连接[41]，鼠李糖乳杆菌上调了趋化因子CXCL2 及其受体CXCR2 在内的多个基因的表达，对角质形成细胞的生长迁移至关重要[42]。植物乳杆菌和唾液乳杆菌还参与角质形成细胞的特定蛋白组学的调节，其中涉及白细胞介素型增强因子结合因子2 和ATP 依赖的RNA 解旋酶等调节蛋白，和细胞因子、核因子-κB、Hedgehog、RUNX 信号失调，这些蛋白质和途径与创面愈合和抗炎密切关联[43]。但不是所有乳杆菌对角质形成细胞都表现为有益作用，如发酵乳杆菌对角质形成细胞的增殖可产生抑制作用[41]。

3.3 益生菌与血管内皮细胞

创面的愈合与内皮细胞的血管生成行为关系密切，多项研究表明，益生菌分泌的后生元在大鼠创面模型中可促进血管内皮细胞的生长。如热灭活乳杆菌制剂[18]、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌和纳豆枯草芽孢杆菌[44]用于大鼠创面模型，可使局部血管生成增加。益生菌促进创面血管内皮生长的机制尚未完全阐明，其中的分子机制可能是促进了低氧诱导因子2α（HIF-2α）的表达，有研究表明鼠李糖乳杆菌在小鼠体内实验中诱导了HIF-2α 的表达上调[45]，这是一种在创面修复中具有招募各种祖细胞、干细胞作用的重要调节因子，参与血管网的形成，加速创面愈合。

4 益生菌调节免疫

4.1 益生菌与巨噬细胞

巨噬细胞表型的变化与慢性创面愈合的过程紧密相关，M1 型巨噬细胞表现为促炎性，产生多种促炎因子，加强炎症，细胞外基质降解，促进病原菌的吞噬；M2 型巨噬细胞表现为抗炎性，抑制炎症因子的产生，促进血管生成，分泌多种生长因子，抑制细胞外基质的降解，加速创面的愈合[46]。在慢性创面中，如糖尿病慢性溃疡，巨噬细胞表型失衡抑制了创面的正常愈合，在糖尿病患者及动物模型中促炎性M1 型巨噬细胞占主导地位，表现为持续的炎症状态并延迟伤口愈合[47]。而益生菌具备调节巨噬细胞表型变化的能力，在糖尿病足创面愈合研究中，植物乳杆菌作为手术清创的辅助手段，在治疗第7 天、14 天、21 天创面取材，免疫组化结果显示促炎性M1 巨噬细胞（CD68+）明显减少，抗炎性M2 巨噬细胞（CD163+）表达高于对照组[17]。植物乳杆菌的胞外囊泡与人单核细胞THP1 细胞共培养后，CD209、C 型凝集素结构域家族5 成员A（CLEC5A）、CD200 R、鞘氨醇激酶1（SPHK1）、A 类清道夫受体1（SRA1)、IL-1 受体和CD163 偏向性高表达，这些细胞表面标志和细胞因子与M2 巨噬细胞相关，促进人单核细胞THP1 细胞向抗炎性M2 巨噬细胞表型分化。即使是在干扰素-γ 和脂多糖诱导的促炎条件下，植物乳杆菌胞外囊泡依然抑制了M1 巨噬细胞的诱导作用，减轻M1 巨噬细胞的炎症影响[48]。然而，益生菌对巨噬细胞的极化作用似乎表现出菌株特异性。目前的研究显示，粪肠球菌、德式乳杆菌、嗜热链球菌等诱导巨噬细胞向M1 型极化，而植物乳杆菌、长双歧杆菌、短乳杆菌、枯草芽孢杆菌等促使M2 型极化，降低炎症反应，促进愈合[49]。

4.2 益生菌与中性粒细胞

益生菌还可以调节中性粒细胞活性，增加其吞噬作用，促进对病原菌的吞噬。植物乳杆菌上清液与糖尿病患者中性粒细胞共培养，可增强糖尿病患者中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬作用，甚至与健康人群相当[17]。中性粒细胞分泌的炎症介质白细胞介素-8（IL-8），对中性粒细胞具有极强的趋化作用。将植物乳杆菌应用于糖尿病患者小腿溃疡治疗中，通过提高IL-8 水平，可促使中性粒细胞从外周血创面聚集来抑制病原菌的定植[18]。

5 总结与展望

慢性创面的迁延不愈是患者及社会沉重的负担，随着细菌耐药性的不断上升，慢性基础疾病引起的局部炎症反应加重，创面愈合越发困难。慢性创面的综合治疗是当今的研究热点，各种抗菌药物、生物支架层出不穷，益生菌治疗提供了一个全新的方向，有望进一步推动慢性创面的综合治疗。但目前的研究多数仅停留在益生菌的抗菌作用及对慢性创面愈合的促进作用，其具体机制的研究尚浅；另外，对于益生菌的给药方式、给药剂量、药物剂型、给药时间等还缺乏统一的认知，目前还无法形成规范化、系统化治疗。但已有的体内、外研究已经表明了慢性创面的益生菌疗法拥有极为广阔的应用前景，有望成为促进慢性创面愈合的有效手段。