皮肤衰老相关的生物标志物及其作用机制的研究进展

王珏 王佳琦 陈珩 邱馨毅 郭晓晴 周栩

【提要】 皮肤老化是人体衰老的直接表现，是遗传和环境因素共同作用的结果，表现为皮肤结构、功能和外观的累积性变化，如皱纹增多、松弛、弹性减退、毛细血管扩张、皮肤色素异常等，延缓皮肤老化对维护人们的心理健康和皮肤的正常生理功能具有重要意义。皮肤老化是一个高度复杂且尚未完全明了的过程，目前还无法根据单一的生物标志物明确检测和评估衰老。本文对衰老相关的生物标志物及其作用机制进行了详细阐述。

皮肤是人体最大的器官，占体质量的10%～15%，是人体与外部环境之间的首要防御屏障，具有重要的功能，包括保护、体温调节、感知、分泌、排泄和免疫等[1-2]。皮肤老化可分为内在老化（自然老化）和外在老化（主要指光老化）。自然老化指的是因年龄增长而产生的变化，不仅发生于皮肤，也发生在所有组织上；而作为人体最外层的器官，皮肤遭受着环境因素的损害，由此产生的皮肤老化被称为外在老化，例如空气污染、吸烟，以及被称为光老化原因的紫外线照射等[3]。无论是内因还是外因产生的老化，都会导致皮肤结构完整性的下降和生理功能的丧失，造成皮肤干燥、功能失调、皮肤病发生率增加[4]。

皮肤衰老相关生物标志物的研究，有助于更深入地理解皮肤老化的分子机制，有助于皮肤老化的早期诊断，并为皮肤年轻化提供潜在的新治疗靶点。本文对皮肤老化的相关原因以及生物标志物及其作用机制进行了详细的阐述。

1 内在老化

皮肤的内在老化是一个渐变的生理过程，内在老化最明显的组织学变化表现在基底细胞层，随着年龄增加，基底细胞层的细胞增殖减少，真皮成纤维细胞的数量减少，细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）中胶原蛋白和弹性蛋白的合成能力下降，特别是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，导致真皮变薄，皱纹增加和弹性减弱。其明显特征是皮肤变薄、干燥、细小皱纹、出汗不足，以及对温度的敏感性增加；皮脂的分泌随着年龄的增长而减少[5]。此外，慢性瘙痒在衰老的皮肤中极为常见，表明与年龄有关的麦克尔细胞的损失导致触觉转为瘙痒[6]。基质金属蛋白酶（MMPs）在衰老的成纤维细胞中表达增加，而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）表达减少，是另一个与皮肤老化有关的因素。然而，由于暴露于外界，皮肤往往同时经历着内在老化和外在老化，以面部、颈部、前臂和小腿皮肤为著[7]。

2 外在老化

早在1969 年，有研究提出，除了内在因素，阳光照射也会导致皮肤老化[8]。暴露在紫外线下导致的光老化约占面部老化的80%以上[9]。阳光中的紫外线根据其波长主要包括三种类型，长波紫外线（UVA，320～400 nm）、中波紫外线（UVB，280～320 nm）和短波紫外线（UVC，200～280 nm）[10]。UVC 具有极强的致突变性，但受阻于臭氧层而无法到达地表；UVA 有很强的穿透能力，可以影响真皮甚至皮下组织区域，但诱变性较弱；UVB 诱变性强，可直接与DNA 发生作用，产生胸腺嘧啶二聚体光产物，导致DNA 损伤[11]。

紫外线导致的光老化会使皮肤变得粗糙、失去弹性、产生皱纹；此外，还会导致皮肤下毛细血管扩张，引起表皮增厚，与内在老化造成的表皮变薄形成鲜明对比[12]。光老化引发了角质细胞活性下降，皮肤更新速度减缓，导致表皮层的屏障功能减弱，临床表现为皮肤干燥和脱皮。与内在老化相比，光老化真皮层的成纤维细胞数量减少更为严重，胶原蛋白和弹性蛋白的合成速率降低，同时分解加速[13]。由于胶原蛋白降解的增加，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白减少，导致真皮变薄；角质细胞中Ⅶ型胶原蛋白的表达减少。Ⅶ胶型原蛋白是真皮-表皮交界处的锚定纤维，由于真皮和表皮之间的连接减弱，导致了皱纹的产生[14]。同时，朗格汉斯细胞减少，导致免疫力下降；无定形弹性纤维积累，胶原蛋白破坏和紊乱，导致皮肤弹性降低[15]。此外，紫外线照射会刺激黑色素细胞，促进黑色素的生成和迁移，从而形成老年斑。紫外线辐射还会导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生，引发有害的氧化应激反应，激活花生四烯酸途径，并介导炎症反应[16]。急性紫外线照射还可能引发晒伤、异常色素沉积，而长期暴露则可能导致恶性肿瘤[17]。

3 皮肤老化的生物标志物

尽管受到不同的刺激诱导，皮肤中的老化细胞有一些共同特征，使其在体外和体内都能被识别。皮肤老化相关的生物标志物，可以评估皮肤老化的程度，以及老化相关疾病导致的变化，并有效识别干预措施的效果对。皮肤衰老相关生物标志物及其作用机制的了解，有助于进一步了解皮肤衰老的现象和机制。

3.1 衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）

Dimiri 等[18]发现，正常状态下溶酶体β-半乳糖苷酶在pH 为4 时可以检测到，而衰老细胞在pH 为6 时亦可检测到β-半乳糖苷酶，被称为衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal），成为识别体外和体内衰老细胞最广泛使用的生物标志物。Lee 等[19]发现，SA-β-gal 活性的增加来源于编码溶酶体β-半乳糖苷酶的基因GLB1。随着年龄增长，有丝分裂后细胞中溶酶体内的脂褐素积累，溶酶体的数量和大小随之增加[20]。体外和体内衰老细胞（低温保存组织）中脂褐素和SA-β-gal 的共定位被证实，表明脂联素也可作为细胞衰老的生物标志物[21]。SA-β-galactivity 与衰老细胞高度相关，但并不是所有的衰老细胞都表达SA-β-Gal，其在老化的成纤维细胞和角质细胞中表达，但在静止状态的成纤维细胞和终末分化的角质细胞中则不表达[18]。

3.2 细胞周期调节器

衰老细胞不可或缺的标志是其稳定的细胞周期停滞：衰老细胞停滞在细胞周期的G1/S 期，失去有丝分裂的能力，但仍保持代谢活性。与静止期不同，衰老细胞的生长停滞是永久性的，不能被任何生理性刺激激活，即使在有利的生长条件下，也丧失了重新进入细胞周期的能力。同时，衰老细胞也不同于终末分化细胞，后者尽管也不可逆地退出了细胞周期，但其是一个明确的发育程序的结果，而细胞衰老是基于细胞的应激反应形成的[22]。衰老细胞退出细胞周期是由p53/p21 CIP1 和p16 INK4a/Rb 肿瘤抑制通路的激活所控制的[23]。p21 是p53 最经典的靶基因。在衰老期，被激活的p21 特异性地与G1 期的细胞周期蛋白/循环蛋白激酶复合物结合，抑制周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2） 的 活 性，导致视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）磷酸化减少和细胞周期退出[24]。细胞受到暂时的应激时，p53 诱导细胞进入静止状态并激活DNA 修复过程，应激消除后，细胞恢复周期。持续应激可激活p16INK4a（CDK4 和CDK6 的抑制剂），导致细胞周期长期停滞[25]。紫外线照射后的人类皮肤成纤维细胞（hDFs）显示p53、p21 和p16 的上调[26]。此外，小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和人类黑色素瘤细胞也显示了同样的结果[27]。

3.3 衰老相关异染色质灶（Senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）

Narita 等[28]发现，衰老细胞的DNA 包含点状异染色质域，极易与非衰老细胞的染色质区分开来。衰老的启动引发了不同异染色质结构的产生和积累，这些结构被称为衰老相关异染色质灶，异染色质区域常常发生组蛋白H3 上第9 位赖氨酸Lys9 的甲基化（K9M-H3），其为异染色质蛋白HP-1（Heterochromatin protein 1，异 染 色 质 整合时必需的衔接分子家族）提供了结合位点，由于衰老细胞中HP-1、K9M-H3 与SAHF 定位的一致性，两者成为标示SAHF 的标志蛋白，可通过DNA 染料DAPI 检测[29]。p16 的过量表达可以通过激活Rb 促进SAHF 的形成，表明p16/Rb 途径在SAHF 的形成中起着重要作用。在用Ras 诱导衰老并抑制p16 或Rb 的细胞中，尽管细胞仍然进入衰老状态，但SAHF 的形成明显减弱[30]。高迁移率蛋白A（High-mobility group A，HMGA）是一种富集在染色质中的非组蛋白，当HMGA 的表达量增加时，SA-β-Gal 的活性增加，SAHF 的形成增强，细胞的生长明显受到抑制。当HMGA 在衰老细胞中被抑制时，SAHF 的形成会减弱，其他衰老迹象也会减少，这表明HMGA 蛋白对SAHF 的形成至关重要[30]。p16 和HMGA 可以以协同的方式共同促进SAHF 的形成。但SAHF 不能在所有物种的衰老细胞中检测到，因此作为一个衰老的生物标志物有其局限性。

3.4 核纤层蛋白B1（Lamin B1）

细胞核通常由核孔复合体、核基质和核纤层组成。核纤层位于内核膜的核基质表面，是一种由核纤层蛋白（Lamin）构成的网状结构。Lamin属于中间纤维蛋白家族，为核膜提供支撑和维持结构稳定性。在动物细胞中，存在A、B 两种Lamin 类型，B 型Lamin 由LMNB1 和LMNB2 编码[31]。近年来，有研究表明，在复制性衰老和致癌基因诱导的衰老中，Lamin B1 的表达降低，通过依赖于p53 和Rb 的信号通路延缓了细胞增殖并促进了细胞衰老[32-33]。此外，Lamin B1 与自噬过程也存在密切关联。在细胞衰老时，核自噬被异常激活，从而导致Lamin B1 的表达下降[32]。Lamin B1 与自噬相关蛋白LC3 结合后，通过囊泡从细胞核运输到细胞质，然后由溶酶体降解。研究发现，通过阻断肽（Lamin B1 类似物）抑制LC3 和Lamin B1之间的相互作用可以延缓细胞衰老[34]。

另外，Lamin B 受体（LBR）和核纤层蛋白相 关 多 肽（Lamina-associated poly-peptide 2α，LAP2α）也显示下调[35]。然而，LBR 在不同表皮层中的表达存在差异，这可能限制了其作为皮肤老化的适当生物标志物的使用。研究发现，Lamin B1 的表达在静止细胞中保持稳定，而LAP2α 的丢失不仅发生在衰老细胞中，也发生在静止细胞中。因此，共同检测Lamin B1 和LAP2α 可以更好地区分衰老细胞和静止细胞[35]。

3.5 端粒

端粒是真核细胞线性染色体末端的DNA-蛋白质复合体，由富含G 的核酸重复序列和蛋白质组成，被认为是细胞衰老的生物标志之一[36]。人类端粒主要由5’-(TTAGGG)n-3’重复DNA 序列构成，总长度2～15 kb。在DNA 半保留复制过程中，由于DNA 聚合酶无法进行3’→5’合成，导致子链末端无法进行扩展。随着细胞分裂次数的增加，端粒逐渐缩短。端粒的关键作用是维持染色体的结构稳定，以阻止染色体融合、降解或不稳定结构形成，端粒缩短使端粒失去保护染色体的能力，缩短至极限时，正常的端粒结构无法维持，细胞就会出现不可逆的生长停滞，从而导致细胞发生衰老和死亡。虽然DNA 损伤不是衰老的生物标志物，但由此产生的端粒功能障碍诱发的病灶（Telomere dysfunction-induced foci，TIF）经常被用来检测和量化衰老细胞[37]。

在灵长类皮肤成纤维细胞中，随着年龄增长，观察到TIF 逐渐增多，端粒酶被激活。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白复合体，由端粒酶逆转录酶（hTERT）、端粒酶RNA 模板（hRNA）和相关蛋白组成[36]，具备自主合成端粒DNA 序列的能力，并将其附加到端粒末端，从而有助于维持端粒的长度，修复断裂的染色体末端，减轻细胞分裂过程中的端粒损伤，减缓细胞的老化过程，进而起到维护遗传稳定性的作用。然而，在人体内，端粒酶的表达水平除了在造血干细胞、生殖细胞和胚胎细胞中较高外，几乎无法在正常细胞中检测到。因此，将端粒酶检测应用于衰老判断时，主要适用于生殖细胞、干细胞和多数癌细胞的研究，而不适用于正常细胞。

3.6 衰老相关分泌表型（Senescence -associated secretory phenotype，SASP）

SASP 是指衰老细胞分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白酶和脂质的现象，通过自分泌和旁分泌途径可能引发机体内的炎症反应，并向周围细胞传递衰老信号[38]。分泌物的组成因衰老触发因素而异，包括促炎因子（IL-1、IL-6 和IL-8 等）、趋化因子（CXCL-1、CXCL-3、CXCL-10）、生长因子（HGF、GM-CSF 和TGF-β 等）、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）和金属蛋白酶（MMPs），以及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）等[39]。SASP 有助于加强衰老细胞的细胞周期停滞，刺激免疫系统清除潜在的致癌细胞，限制纤维化，促进伤口愈合和组织再生；另外，SASP 还可能介导了慢性炎症，加速机体老化，刺激肿瘤细胞的生长。随着年龄的增长，机体的免疫功能下降、自噬失调和端粒缩短等变化导致衰老细胞的积累增多，从而引发了炎症因子水平的上升，这可能进一步促使疾病发生。因此，SASP 可被视为细胞老化的一个重要特征[40]。

研究指出，IL-6 与由DNA 损伤引起的角质细胞、黑素细胞和成纤维细胞的老化过程相关联[41]。在老化的成纤维细胞、上皮细胞以及由化疗诱导的老化肿瘤细胞中，IL-1 的表达增加，能够与IL-1 受体或Toll 样受体结合，进而激活NFκB，促进SASP 的表达[42]。Quan 等[43]在年龄老化和光老化的皮肤中观察到MMPs 的高水平表达，以及胶原蛋白基质的快速降解。

研究衰老对细胞或组织微环境的影响时，SASP同样具有重要的生物学意义；然而，SASP 作为皮肤老化的生物标志物有一定的局限性，比如IL-6和IL-8 也参与炎症反应等其他生理过程，因此需结合其他生物标志物来共同判断衰老的发生[44]。

3.7 皮肤老化的其他生物标志物

皮肤老化过程中胶原蛋白持续减少，而皮肤胶原蛋白中以羟脯氨酸的含量最高，因此羟脯氨酸可以作为评价皮肤老化的一个指标[45]。透明质酸是一种酸性黏多糖，由皮肤中的纤维母细胞分泌，具有重要的保水作用，其含量随着年龄的增加而逐渐减少[46]。Ishitsuka 等[47]发现，卤化酪氨酸在光暴露和光保护的皮肤中随年龄增长而增加，表明其可能是一个有用的皮肤老化生物标志物。在衰老的细胞中，高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1）从细胞核转移到细胞质和细胞外空间，促进SASP 的释放，如IL-1β、IL-6 和MMP-3[48]。

综上所述，皮肤老化是人体衰老的直接表现，是遗传和环境因素共同作用的结果，延缓皮肤老化对维护人们的心理健康和皮肤的正常生理功能具有重要意义。检测衰老生物标志物可以对体外或体内的衰老细胞进行定性或定量分析，并有助于对衰老组织和机体中细胞衰老的功能进行研究。但是，目前的生物标志物存在很多局限性，尚无一种生物标志物能够准确、稳定地检测出衰老细胞。因此，我们需要在不同情况下选择合适的生物标志物，并且继续不断发现、改进新的生物标志物和检测皮肤老化的方法，以更进一步理解皮肤衰老的生理、生化机制。