基于网络药理学探讨百合知母汤抗焦虑与失眠的分子机制*

许海燕，刘艳红，王 珊，侯敏娜，王 青，彭修娟

陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046

焦虑症是以焦虑为主要特征的神经症［1］，其可导致或加重失眠，反过来失眠也可加重焦虑，二者相互影响，形成恶性循环［2］。失眠不仅降低了焦虑患者的生活质量，而且可能引发糖尿病、高血压、认知障碍等疾病。焦虑症属中医“百合病”“焦躁”“怔忡”范畴［3］，张仲景《伤寒杂病论》载：“心中烦，不得卧”“心烦，不得眠”等。清代蒋宝素《问斋医案》明确记载：“惊悸、怔忡、不寐、汗眩、饥嘈乃一体之病。”可见，焦虑、失眠属中医百合病等范畴。

百合知母汤［4］出自张仲景《金匮要略·百合狐阴阳毒病脉证治第三》，由百合、知母组成，其中百合味甘微苦，性寒；归心肺经；具有清心安神，养阴润肺功效；主治阴虚燥咳，虚烦惊悸，失眠多梦，精神恍惚等症［5］。知母味甘苦，性寒；归肺、胃、肾经；具有清热泻火、滋阴润燥功效；用于外感热病，肺热燥咳，内热消渴，肠燥便秘等症［6］。百合甘寒清润而不腻，知母甘寒降火而不燥，百合偏于补，知母偏于泻，二药伍用，一润一清，一补一泻，共奏润肺清热，宁心安神之效。故百合知母汤可治疗心烦不安、失眠、情志不遂、精神恍惚等症及百合病［7］。

中医药整合药理学研究平台（integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine，TCMIP）V2.0 数据来源于ETCM［8］（http：//www.ehbio.com/ETCM/）中医百科全书数据库。本研究数据来源于TCMIP V2.0（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）“中药材数据库”“中药成分数据库”“中药靶标数据库”和“疾病相关分子库”等。其中与中药、疾病相关的靶标基因及相关数据来源于Drugbank、在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM）、基因相关性数据库（DisGeNET）、人类疾病表型特征数据库（human phenotype ontology，HPO）、基因本体（gene ontology，GO）、药物靶标数据库（therapeutic targetdatabase，TTD）等。TCMIP V2.0 镶嵌 了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、PDZ Base、MINT、DIP 等数据库中的蛋白-蛋白互作网络（proteinprotein interactions，PPI）数据。3种拓扑结构特征值包括：连接度（Degree）、介度（Betweenness）、紧密度（Closeness），以确定中药矫正疾病失衡网络的候选靶标。本研究借助TCMIP V2.0 以百合知母汤为研究对象，初步阐明其抗焦虑与失眠的作用机制，为百合知母汤的进一步深入研究提供理论及数据支持。

1 研究方法

1.1 百合知母汤化学成分来源在TCMIP V2.0平台的“中药材数据库”项下分别以“百合”“知母”为关键词进行检索，收集两药的化学成分，建立百合知母汤的化学成分数据库。

1.2 百合知母汤候选靶标来源在TCMIP V2.0平台“疾病相关分子集及其功能挖掘数据库”中，分别以目标疾病“Anxiety”“Insomnia”为关键词进行检索，获得与焦虑、失眠相关的靶点。然后在“中药（含方剂）靶标预测及功能分析数据库”中，依次添加“百合”“知母”，预测百合知母汤化学成分库中成分靶标，选择“相似性分数≧0.8”的成分预测靶标作为候选靶标。应用TCMIP V2.0 研究平台采用二维结构（.mol或.sdf）进行相似性比对，以Tanimoto系数定义的相似度计量方法进行相似性打分，与FDA上市药物的化学结构进行比对［9］。

1.3 PPl通过TCMIP V2.0获得百合知母汤的潜在靶标与焦虑及失眠疾病靶标之间的PPI信息［10］。

1.4 中医药关联网络构建与关键网络靶标基因功能挖掘在TCMIP V2.0 平台的“中医药关联网络挖掘数据库”中，建立百合知母汤作用的潜在靶标与焦虑及失眠疾病靶标之间的相互作用网络，通过计算网络节点的连接度（Degree）、介度（Betweenness）和紧密度（Closeness），筛选网络中的核心节点基因，作为百合知母汤抗焦虑与失眠的关键靶标网络。根据中药方剂、中药材、中药成分、核心靶标、通路、疾病和证候之间的关联性，可任意选择不同类型节点，构建中药多维关联网络，筛选百合知母汤关键网络靶标基因显著参与的生物学反应（GO-Biological Process）、所行驶分子功能（Molecular Function）及其所在细胞内定位（Cellular Component）；依托Reactome 数据库的Pathway信息，筛选百合知母汤关键网络靶标基因显著参与的分子通路（Reactome-Pathway）。依托ETCM 数据库的疾病和表型数据库，筛选百合知母汤关键网络靶标基因显著相关的疾病和表型。最终形成“中药方剂-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病关键病理环节”多层次网络关联图［11-12］。

2 结果

2.1 百合知母汤靶点预测结果共得到百合化学成分12 种，知母化学成分42 种，主要为挥发油类、多糖类、生物碱类、有机酸类、甾醇类、黄酮类、皂苷类等。为了保证靶标预测结果可信度，设定百合、知母中化学成分与FDA 药物之间的相似性分数≥0.8，得到二者的靶标数目分别为221、196个，其中共有靶标133 个，包括糖皮质激素受体基因（glucocorticoid receptor gene，NR3C1）、重组蛋白（Recombinant Protein，GABRG1）、雌激素受体1（Elabscience，ESR1）、多克隆抗体（polyclonal antibody，GABRA3）、凝集素（galactoside-binding，LGALS2）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、ATP 酶α2 亚基基因（Transporting Alpha 2 Polypeptide，ATP1A2）、小鼠多克隆抗体（mouse polyclonal antibody，CYP2B6）、干扰素β1（interferon beta 1，IFNβ1）、γ氨基丁酸A型受体γ2亚单位基因（γgamma-aminobutyric acid A receptor gamma 2，GABRG2）等。动物实验表明［13］百合知母总皂苷具有良好的镇静催眠作用，并与百合、知母单用比较优势明显，可知百合、知母配伍在镇静催眠方面具有协同增效作用。百合知母汤候选靶标基因功能涉及神经系统过程、突触传递、氨基丁酸信号通路、膜电位调节、类固醇激素介导的信号通路、离子传输、类固醇代谢过程、异型生物质的代谢等生物学过程。中药候选靶标涉及通路有核受体转录途径、氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受体激活、膳食碳水化合物消化、微管蛋白折叠通路、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic receptor acid，NMDA）受体介导的受神经元传递的负调控、外源性物质等通路。

2.2 焦虑与失眠疾病靶点收集结果获得与焦虑相关的疾病靶点210 个，与失眠相关的疾病靶点27个，焦虑与失眠共有靶标分别是邻锌指结构域1B（bromodomain adjacent to zinc finger domain 1B，BAZ1B）、兔单克隆抗体（rabbit anticpox polyclonal antibody，CPOX）、（人）重组蛋白［（Human）recombinant protein，DCTN1］、弹性蛋白（elastin，ELN）、含GTF2I 重复域1GTF2I［（Human）repeat domain containing 1，GTF2IRD1］、人体黑素促皮质素3 受体（human mammary carcinoma cell membrane proteinase，HMBS）、单丝氨酸蛋白激酶1抗体（LIMK1 antibody，LIMK1）、多发性内分泌肿瘤1 型综合征（multiple endocrine neoplasia，MEN1）、朊蛋白基因（prion protein gene of large animals and human beings，PRNP）、复制因子C亚单位（2replication factor C subunit2，RFC2）、转导蛋白（β）样2［Transducin（β）-like 2，TBL2］。

2.3 百合知母汤抗焦虑与失眠的“药物靶标-疾病靶标”核心网络共得到128个与焦虑、失眠以及药物相关核心网络靶标，其中与药物相关靶标14个，与疾病相关靶标114个。利用PPI模块构建核心网络靶标图，平台设定同时满足大于节点“连接度”“介度”“紧密度”的中位数为卡值，得到关键核心靶标54个，如GABRA1、NFKB1、AR、SMC1A、PIK3CA、NR3C1、DRD2 等。已知药物靶标14 条，即NFKB1、NFKB2、NR3C1、GABRA1、GABRA3、GABRA4、GABRA5、NCOA2、ESR1、CASP3、AHR、AR、CYP2D6、GABRB2。药物与疾病共有靶标2 条。其中，与焦虑相关靶标为NR3C1，与失眠相关靶标为GABRA1。NR3C1［14］可影响HPA 轴的负反馈调节，改变个体对应激的反应性，而对应激的过度反应是焦虑障碍的重要诱因，研究表明在焦虑障碍中HPA 轴通常表现为较弱的负反馈抑制，由此可认定NR3C1 为焦虑障碍的重要候选基因。也有研究发现糖皮质激素［15-16］可使中枢神经系统的兴奋性增高，导致患者出现失眠或加重原有失眠，引发焦虑、抑郁，甚至诱发精神失常。GABRA1是GABA的受体，而GABA［17］是一种广泛存在于中枢神经系统中的抑制性神经递质，能够抑制神经系统神经元，具有神经保护作用，有催眠、镇静和抗焦虑等功能。有实验发现，电针刺激能增加失眠大鼠GABA及GABRA1表达与分泌，抑制觉醒和兴奋，促进睡眠，调节睡眠-觉醒周期平衡。通过实验可看出GABRA［18-19］等基因所参与的神经活性配体-受体相互作用通路与神经递质的传递在失眠的治疗过程中发挥重要作用。见图1。

2.4 百合知母汤抗焦虑与失眠的基因功能及通路信息通过关键靶标功能信息推测，百合知母汤抗焦虑及失眠主要通过调节氨基丁酸信号通路、氯离子跨膜运输等信号转导效应和基因表达改变GABA含量，从而抑制焦虑症、抑郁症、癫痫、帕金森等精神心理障碍或中枢神经系统疾病的发生［20-21］。并通过增加GABA与GABAA受体结合后氯离子通道的开放频率，起镇静催眠作用［22-23］。见表1。

表1 百合知母汤抗焦虑与失眠候选靶标基因及数目

百合知母汤抗焦虑与失眠的分子通路主要涉及GABA受体激活、GABAA受体激活、胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）调节胰岛素分泌、胰高血糖素信号中PKA的激活、细胞内受体的SUMO化（SUMOylation）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR1）信号通路等。通过调节GABA与GABAA受体含量可抑制焦虑，起镇静催眠作用。GLP-1［24-25］不仅可通过保护胰岛生存环境对抗细胞因子对细胞的损伤，改善细胞对葡萄糖敏感性，刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，而且在中枢神经系统中具有重要作用，包括调节摄食行为、胰岛素敏感性、心血管功能以及抗焦虑、抗抑郁、保护神经等作用。FGFR的过度表达或过度激活与多种肿瘤、骨骼系统疾病、关节炎等相关［26］，而肿瘤、关节炎等疾病都能引起焦虑与失眠［27-28］，百合知母汤可通过调节FGFR表达，抑制多种疾病引起的焦虑与失眠。有研究表明SUMO 化修饰及其路径与人类疾病相关［29-30］，SUMO化修饰与癌症、神经退行性疾病、糖尿病、脑损伤等疾病有关，如SUMO 蛋白具有保护脑神经细胞功能。研究发现，人体处于中风或癫痫状态时，SUMO化降低了红藻氨酸受体的作用，从而保护神经细胞免受损失，防止大脑神经细胞过度兴奋，起抗焦虑及失眠作用。故百合知母汤通过多种途径、多种信号通路作用于多种靶点发挥功效。见表2。

表2 百合知母汤抗焦虑与失眠候选靶标的分子通路及数目

2.5 百合知母汤抗焦虑与失眠的“中药-靶标-通路-疾病”网络可视化分析利用核心靶标及其与中药成分和疾病之间的关系绘制“中药-成分-关键药靶-通路”网络可视化图，可以看出百合知母汤化学活性成分有9 个、直接靶标54 个及25 条主要通路，其中皂苷类、黄酮类、挥发油类、有机酸类等可作用于药物与疾病共有靶标NR3C1、GABRA1，如百合中的甾醇、百合皂苷、蒽醌类、生物碱类，知母中的知母皂苷、芒果苷、黄酮类、挥发油、双苯吡酮类等。见图2。

图2 “中药-成分-关键靶标-通路”多维关联网络

有研究发现［31］，生物碱类、挥发油类、黄酮类、皂苷类均具有镇静催眠作用。百合具有明显镇静安神作用，WANG 等［32］研究发现百合的镇静催眠作用与其总皂苷及薯蓣皂苷具有明显相关性，表明百合皂苷可能是百合发挥镇静催眠作用的主要药效物质基础。知母中的皂苷类可减少小鼠活动次数，延长小鼠睡眠时间［33］。研究表明，百合知母总皂苷具有显著镇静催眠作用，能减少个体活动次数，延长戊巴比妥钠所致睡眠时间，并随着剂量增加，镇静催眠作用也增加［34］。有课题组基于其研究成果［35］，对调控睡眠较为重要的GABA 进行靶标分析，并将所得化合物与GABA通路下的GABRA1蛋白进行分子对接，发现知母皂苷和GABRA1 蛋白分子对接最佳。从知母中分离出的木脂类化合物被证明是较强的cAMP 磷酸酯酶抑制剂，能延长环戊巴比妥所致睡眠时间［36］。故百合知母汤的抗焦虑与失眠作用与其所含总皂苷含量有关。

3 讨论

失眠是临床常见症状，数据显示，中国存在失眠的人群为42.5%，严重危害人们身心与生活质量。失眠症状常与其他疾病同时或相继发生，临床中失眠与焦虑障碍和抑郁症的共患率较突出［37］。其中70%的焦虑障碍患者伴随睡眠紊乱，广泛性焦虑障碍、惊恐障碍和创伤后应激障碍与失眠的关系更为密切，病情严重者甚至可出现自杀行为［38］。西医治疗焦虑、失眠多采用艾司唑仑、劳拉西泮等药物，但多数患者依从性差或服用不当容易形成耐药性及依赖性的缺点，影响疗效及安全性。中药方剂治疗焦虑、失眠具有疗效稳定、不易复发、无成瘾性、无依赖性的优势，故越来越多的焦虑与失眠等神志精神疾病多用中医药进行防治。

百合知母汤加减用于治疗焦虑及失眠症临床虽有确切疗效［39］，但目前缺乏对其活性成分及其作用机制的研究。本研究共得到百合知母汤活性成分9 个，分别作用于54 个直接靶标和25 条主要通路上，其药效物质基础主要为皂苷、黄酮、甾醇等。有研究发现［40］抗焦虑有效成分涉及黄酮类、生物碱类、有机酸和酚类等多种成分。黄酮与皂苷可作用于GABA 受体，调节激素水平、细胞因子、生理节律及兴奋性氨基酸（谷氨酸及天门冬氨酸）等的异常，达到催眠抗焦虑目的。

本研究是基于网络大数据所做的预测，研究结果还需要通过进一步的实验研究加以验证。