靶向金黄色葡萄球菌的纳米光敏剂UBI/PCN-224的制备和性能验证*

闫睿,李梦乔,柴韶斌,汪茜△

(1.中国人民解放军总医院第三医学中心 胸外科, 北京 100039;2.中国人民解放军总医院第三医学中心 急诊科, 北京 100039)

0 引言

开放性损伤是交通事故、灾难、战争最主要的伤情之一。伤员在皮肤屏障受损后,细菌进入开放性伤口,可诱发皮肤浅表、内脏深层甚至全身感染[1]。抗生素一直作为对抗细菌感染的重要手段[2-3]。然而,由于抗生素滥用导致的细菌耐药问题已越发普遍[4],世界卫生组织预计,因耐药菌感染的死亡人数将以约70万人/年的速度增长,至 2050 年,或将达到1 000万人/年[5]。因此,亟须寻求合理的策略遏制多重耐药菌的增长。

人类是金黄色葡萄球菌的天然宿主,当机体皮肤被破坏,广泛存在于皮肤上的金黄色葡萄球菌-正常菌群平衡关系被打破,可引起皮肤和软组织感染、败血症、脓毒血症等局部或全身性的严重感染[6-7]。早期使用抗生素虽然能减少伤口污染及短期内继发感染的机会,但也增加了因抗生素滥用导致产生耐药菌的几率。当创口较深、创面较大时,因表皮及皮下组织破损,污染物及表皮附着的细菌可进入深部创面,形成菌落定植及混合细菌感染,若伤口分泌物引流不畅,出现脓液聚集包裹,致使全身抗菌药物的使用效果更差,更易导致细菌耐药的发生[8]。

光动力抗菌治疗(antimicrobial photodynamic therapy,aPDT)利用激发光照射光敏剂发生光化学反应,产生大量高毒性的活性氧,使病原微生物细胞破损、蛋白质变性、DNA断裂,从而达到杀灭细菌的目的[9],其优势是只对暴露在激发光源下的病原菌进行杀伤,不会破坏机体微生物稳态,并且能避免耐药的发生。但由于光敏剂水溶性和稳定性差、易聚集、修饰困难,无法特异识别病原菌,导致光照局部正常组织细胞死亡,抑制新生肉芽的生长,阻碍伤口愈合[10-11]等原因,限制了光敏剂在伤口感染治疗领域的应用。为此,Dobrindt等[12]将硼酸分子修饰在光敏剂硅(IV)酞菁上,使其具有特异性识别细菌表面多糖的能力,进一步包覆聚乙烯醇增加其水溶性,实现高效杀伤革兰氏阴性菌的目的。Liu等[13]将光敏剂叠氮-丙氨酸(d-AzAla)装载到金属有机框架(MIL-100)孔道中,该纳米材料能高效富集到感染部位,并在感染局部高过氧化氢作用下,快速分解释放光敏剂,d-AzAla能选择性插入到细菌细胞壁,精准清除病原菌。Nagpal等[14]构建红光和近红外光激活的纳米光敏剂-磷化铟量子点,研究发现磷化铟量子点在较低浓度,可选择性杀死耐药病原菌,且不会对正常组织产生毒副作用。Heyne等[15]将银纳米颗粒表面包覆硅层,并共价耦联光敏剂玫瑰红,形成纳米立方体光敏剂。利用等离子体显著增强邻近光敏剂产生单线态氧的特性,达到高效清除革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌的效果。上述发现均为开发更高效的杀菌体系提供了技术支持。研究表明,纳米光敏材料在治疗感染时,具有很好的局部治疗效果,在有效杀死细菌同时,不会损害人体细胞,同时也有采用aPDT进行抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的研究,取得了较好的治疗效果[16]。aPDT因其诸多优点成为有望解决细菌的耐药性问题的研究方向。

上述研究需要针对不同细菌,选择不同的光敏剂或者纳米骨架,再加上小分子物质的靶向特异较差,在实际应用中,组织非特异损伤较重,其应用具有一定的局限性。因此,开发针对感染创面,具备靶向作用的纳米光敏剂,具有重要的临床应用价值。为此,本研究基于抗菌肽和卟啉光敏剂,使用溶剂热法合成构建了可靶向金黄色葡萄球菌的纳米光敏剂UBI/PCN-224。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

本研究使用以下材料,采用溶剂热法制备卟啉基纳米颗粒:八水氧氯化锆(ZrOCl2·8H2O,德国默克Sigma-Aldrich)、四羧基苯基卟啉钴(TCPP,西安齐岳)、苯甲酸(德国默克Sigma-Aldrich)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,上海阿拉丁)、丙酮(上海阿拉丁)、抗菌肽(UBI,上海阿拉丁)、1,3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF,德国默克Sigma-Aldrich) 。

纳米颗粒制作完成后,通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)(S-3400N,日本Hitachi)、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)(Jem-1200EX,日本TEOL)、Malvern 激光粒度仪(NanoZW90,爱尔兰Malvern)、冷冻离心机(3-30KS,德国Sigma)、超纯水机(TTL10A-北京同泰联科技)、光谱仪(F-4600,日本Hitachi)、数控超声清洗器(CPX2800H,美国Branson)、640 nm激光器(K808DB2RN,北京凯普林),对所制备的纳米材料进行检测,验证材料的物理性质及生物化学特性。

1.2 靶向金黄色葡萄球菌的纳米光敏剂UBI/PCN-224的制备

卟啉是一种良好的光敏剂,可在660 nm激光照射下产生活性氧。通过热溶剂法[17],可制备以卟啉为基础的纳米光敏材料UBI/PCN-224。

1.2.1PCN-224纳米卟啉材料制备 取八水氧氯化锆2 mg,四羧基苯基卟啉钴6 mg,苯甲酸56.2 mg,混合后放入5 mL圆底烧瓶中,加入2 mLN,N-二甲基甲酰胺,超声使其溶解,搅拌均匀。将混合液加热至90 ℃,600 rpm磁力搅拌5 h。反应结束后,自然冷却至室温,12 000 rpm、20 min离心收集产物。离心产物用N,N-二甲基甲酰胺重悬后,再次12 000 rpm、20 min离心,弃上清、收集产物。加入丙酮2 mL重悬,12 000 rpm、20 min离心,弃上清。重复上步,丙酮洗涤3次,弃上清后,离心后产物60 ℃真空干燥箱干燥24 h,得到卟啉基纳米材料,即PCN-224[18]。

1.2.2PCN-224连接UBI 取PCN-224 20 mg,加入超纯水5 mL,配成4 mg/mL水溶液。加入抗菌肽UBI(29-41-Ubiquicidine)水溶液,充分混合均匀后,震荡反应24 h后,12 000 rpm,30 min离心,弃上清收集沉淀。20 mL超纯水重悬后,再次12 000 rpm,30 min离心后收集沉淀。重复离心收集沉淀2次后,产物分散入5 mL水中,4 ℃冰箱中保存备用。制备产物见图1。

1.3 UBI/PCN-224表征分析

1.3.1形貌表征 TEM是一种把经加速聚集的电子束透射到非常薄的样品上,进行显像的显微镜。可看清小于0.2 μm的细微结构,目前TEM分辨力可达0.2 nm。将制备好的纳米颗粒在超声波清洗仪中分散均匀后,将其稀释至合适倍数,用移液枪滴20 μL至铜网上,室温晾干后准备测试。使用TEM获取PCN-224和UBI/PCN-224的形态图片。

1.3.2Zeta电位测量检测连接效果 Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量。本实验采用Malvern 激光粒度仪对PCN-224和UBI/PCN-224纳米颗粒进行 Zeta 电位测定。样品平衡时间 60 s对样品测试3次,结果取3次平均值。

1.3.3纳米光敏材料PCN-224光敏效果评价 DPBF是一种单线态氧指示荧光探针,对单线态氧(O2) 具有高特异性,可形成内过氧化物并分解成1,2-二苯基苯。DPBF可用于检测活性氧(ROS)的生成。具体而言,单线态氧与DPBF发生环氧化反应导致其420 nm的吸收光谱降低,其降低水平与生成的单线态氧水平呈正相关。

采用660 nm激光照射含有8 mM DPBF的PCN-224溶液10 μg/mL,每隔2 min,用紫外-可见-近红外光谱仪记录DPBF在300～600 nm处的吸光度和420 nm处的吸收峰。

1.3.4纳米光敏材料UBI/PCN-224靶向金黄色葡萄球菌作用验证 将纳米材料PCN-224、UBI/PCN-224分别和金黄色葡萄球菌溶液混合后,光照4 h,将两组培养液离心,铺片,固定后,进行扫描电镜成像观察。

2 结果

PCN-224纳米金属颗粒几何结构完整、颗粒之间独立、无杂质融合、结晶度良好,纳米颗粒的粒径大小在80 nm左右。将PCN-224连接UBI后,得到的纳米复合材料UBI/PCN-224颗粒大小增长到100 nm,但其颗粒结构及形态未见明显变化,说明UBI结合成功,体积相应增大,但并未破坏其纳米框架,见图2。表明成功地合成了UBI/PCN-224纳米复合材料。

PCN-224连接UBI后,Zeta电位较PCN-224有明显提高,表明二者材料有明显差异。由于PCN-224、UBI均带正电荷,二者连接成功后,Zeta电位从12.3 mV升至23 mV,说明UBI靶向分子成功连接到PCN-224表面,使其正电位出现增高(见图3),PCN-224及UBI/PCN-224纳米材料Zeta电位测量结果存在明显差异。

DPBF指示剂可与单线肽氧发生作用,导致吸收峰下降,加入DPBF后,对纳米光敏材料UBI/PCN-224单线态氧活性进行检测。图4(a)中,随着光照时间的增长,第0、2、4、6、8和10 min在420 nm波长处的吸收峰峰值,分别为0.89、0.82、0.77、0.71、0.65和0.61,呈现逐渐下降趋势。研究表明,在光照条件下,纳米光敏材料UBI/PCN-224逐渐产生了单线态氧,同时单线态氧与DPBF特异性结合,导致其吸收峰逐渐下降。而图4(b)中,在无光照的暗环境下,420 nm波长处的吸收峰无任何变化,表明此时并未有单线肽氧结合DPBF,同时也证明了纳米光敏材料UBI/PCN-224在无光环境中不释放单线态氧,说明其暗毒性较低。图4(c)为420 nm吸收峰数据随时间变化的数值,直观地表现了光照条件下单线态氧逐渐产生的过程。从数值变化看,光照可导致纳米光敏材料UBI/PCN-224产生单线态氧成线性增加,也表明了纳米光敏材料UBI/PCN-224的杀菌活性在光照后随即产生,并且随时间持续增加。

图2 透射电镜图像

图3 PCN-224和UBI/PCN-224纳米材料Zeta电位

由图5可知,PCN-224在和金黄色葡萄球菌共培养后,可见较小的金黄色葡萄球菌聚集,直径小于60 μm,同时背景中散在单一金黄色葡萄球菌。而UBI/PCN-224和金黄色葡萄球菌培养经光照后,可形成直径100 μm以上的纳米-细菌聚合物,而且图片背景清晰,无散在细菌,证明连接UBI后,纳米光敏材料具有有效的金黄色葡萄球菌结合能力,同时由于纳米颗粒间和细菌的聚合特性,可促进细菌聚集,达到限制细菌感染扩散和杀菌的作用。扫描电镜结果显示,连接UBI后的纳米光敏材料,能更好的和金黄色葡萄球菌结合聚集,发挥其杀菌作用。

图4 (a).光照条件下,不同时间DPBF吸收峰变化;(b).无光照条件下,不同时间DPBF吸收峰变化;(c).光照环境和暗环境下,DPBF 420 nm波长处吸收峰随时间变化图 Fig.4 (a).Under illumination conditions, the absorption peak of DPBF changes at different times;(b). Under the condition of no light, the absorption peak of DPBF changes at different times;(c). Diagram of absorption peaks at DPBF 420 nm wavelength with time in light and dark environments

图5 (a). PCN-224和金黄色葡萄球菌共培养扫描电镜成像;(b).UBI/PCN-224和金黄色葡萄球菌共培养扫描电镜成像

3 结论

本研究选择卟啉作为光敏剂原料,使用氧化锆作为纳米骨架,制成纳米光敏剂的主要作用结构,并通过连接UBI,获得更强的靶向细菌效果。其聚合作用还可限制细菌感染的扩散,提高杀菌效果,降低非特异损伤。目前研究完成了材料的制备和性质验证,后续需对UBI/PCN-224的生物抗菌活性的剂量效应关系和实际应用效果进行更深入的探索。本研究提出了一条更多样的靶向纳米光敏材料的研究思路,可将基础纳米光敏材料,通过连接不同的靶向分子,达到更加精准和灵活地制作靶向纳米光敏剂的目的,具有广泛的应用价值。