嗜热链球菌抑制法测定鲜乳中抗生素残留检验方法的优化

◎ 张 艳，王琳帆，张文博，陈奕杉，贺珊珊

（富平县检验检测中心，陕西 富平 711700）

抗生素不仅是人类治疗疾病的常用药物，还是治疗动物疾病的常用药物[1]。目前常用的抗生素主要有青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素等。该类抗生素对大量的化脓性细菌，如葡萄球菌、链球菌等均有很好的抑制作用，从而可以治疗奶牛的乳房炎等疾病。很多养殖户为了治疗或者预防奶牛乳房炎，存在抗生素用药不当或滥用的情况。抗生素容易在动物体内及鲜乳中残留，不仅影响鲜乳品质，还会危害人类健康[2]。《食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验》（GB/T 4789.27—2008）第一法嗜热链球菌抑制法，就是基于抗生素对链球菌属的抑制原理来测定鲜乳中的抗生素残留[3]。通过调研当地乳品加工企业以及检验检测机构，发现该检验方法准确度低，经常出现假阴性结果，目前多用试剂盒免疫分析法进行抗生素检测。由于试剂盒法仅能作为企业内检，无法出具正式检验报告，故需对该方法进行优化，提高灵敏度。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

鲜羊乳，富平县韦村奶山羊养殖户。

嗜热链球菌菌株（菌株标准编号：ATCC14485；批号：20210330），广东省微生物菌种保藏中心；无抗生素脱脂牛乳粉（伊利脱脂奶粉，批号：20220310），New Zealand Nutritional Wellness Limited；2,3,5-氯化三苯四氮锉（TTC）（CAS NO：298-96-4；批号：211226），上海蓝季生物；青霉素G 钾标准品（CAS NO：113-98-4；批号：21070867），坛墨质检标准物质中心；链霉素标准品（CAS NO：3810-74-0；批号：130308-201514），中国食品药品检定研究院；庆大霉素标准品（CAS NO：1405-41-0；批号：130326-201716），中国食品药品检定研究院；卡那霉素标准品（CAS NO：25389-94-0；批号：130319-201511），中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器设备

SPX-150B-Ⅱ恒温培养箱，上海悦丰仪器仪表有限公司；HH-S8A 电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；天平、LS-100HG 立式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；BSC-1300-Ⅱ A2 生物安全柜，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；MX-S可调式混匀仪，大龙兴创实验仪器北京股份有限公司；无菌刻度吸管（1 mL，具0.01 mL 刻度；10.0 mL，具0.1 mL 刻度）；移液枪（50～200 μL，200～1 000 μL）；无菌试管（18 mm×180 mm）。

1.3 实验方法

1.3.1 检验原理

样品经80 ℃杀菌后，添加定量的嗜热链球菌菌液，经过培养嗜热链球菌开始增殖。这时加入代谢底物2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride，TTC），若样品中不含有抗生素或者抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，还原TTC 为红色物质[4]。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则嗜热链球菌增殖受到抑制，TTC 不会被还原，保持原色。

1.3.2 试剂准备

（1）灭菌脱脂乳。称取9.00 g 无抗生素脱脂牛乳粉，加入50 ℃的蒸馏水90 mL，搅拌使其完全溶解，并分装于试管中（9 mL/支），115 ℃灭菌20 min。

（2）4% 2,3,5-氯化三苯四氮锉水溶液。称取1.00 g TTC 溶解于25 mL 蒸馏水中，115 ℃灭菌20 min。

（3）青霉素G 参照溶液。用无菌磷酸盐缓冲液配制青霉素G 钾标准溶液约300 IU·mL-1（即190 mg·L-1），用灭菌无抗脱脂乳稀释至0.06 IU·mL-1（即38 μg·L-1），继续用灭菌无抗脱脂乳稀释至0.006 IU·mL-1（即3.8 μg·L-1），备用。

1.3.3 标准溶液配制

（1）青霉素标准溶液（0.3 mg·L-1）。精确称取30 mg 青霉素G 钾标准物质于100 mL 容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的青霉素标准溶液，再用无菌磷酸盐缓冲液稀释成为0.3 mg·L-1的青霉素标准溶液，备用。

（2）链霉素标准溶液（5.0 mg·L-1）。精确称取50 mg 链霉素标准物质于100 mL 容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的链霉素标准溶液，再用无菌磷酸盐缓冲液稀释成为5.0 mg·L-1的链霉素标准溶液，备用。

（3）庆大霉素标准溶液（3.0 mg·L-1）。精确称取30 mg 庆大霉素标准物质于100 mL 容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲液溶解并定容，配制成300 mg·L-1的庆大霉素标准溶液，再用无菌磷酸盐缓冲液稀释至3.0 mg·L-1的庆大霉素标准溶液，备用。

（4）卡那霉素标准溶液（5.0 mg·L-1）。精确称取50 mg 卡那霉素标准物质于100 mL 容量瓶中，用无菌磷酸盐缓冲液溶解并定容，配制成500 mg·L-1的卡那霉素标准溶液，再用无菌磷酸盐缓冲液稀释成为5.0 mg·L-1的卡那霉素标准溶液，备用。

1.3.4 测试菌液准备

（1）活化菌种。取一环嗜热链球菌菌种，接种于9 mL 灭菌脱脂乳中，置于36 ℃生化培养箱中培养15 h 后，放于冰箱冷藏备用。

（2）测试菌液。将活化后的菌种接种于9 mL 灭菌脱脂乳中，于36 ℃生化培养箱中培养15 h 后，混匀，取1 mL 培养液加入9 mL 灭菌脱脂乳，混匀稀释成测试菌液。

1.3.5 样品准备

以鲜乳为样品，分别加入国标中1 倍检出限、10 倍检出限、100 倍检出限的青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素标准溶液，配制成表1中不同加标浓度、不同加标物质的12 种加标样品。

表1 样品加标浓度表

1.3.6 样品处理及培养

分别取表1 中12 组加标样品9 mL 于试管中，每份样品另做一份平行样，同时再做阴性对照（9 mL 灭菌脱脂乳）和阳性对照（9 mL 0.06 IU·mL-1青霉素G 参照溶液）各一份，所有试管置于80 ℃水浴加热5 min，冷却至37 ℃以下，加入测试菌液1.0 mL，轻轻混匀试管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，涡旋混匀，36 ℃避光水浴培养30 min，观察颜色变化。若颜色没有变化，于36 ℃避光水浴中继续培养30 min观察最终颜色变化（当试管中样品呈乳白色则为抗生素阳性结果，若试管样品呈红色则为抗生素阴性结果。阳性结表明样品中含有高于检出限的抗生素；阴性结果表示样品中不含有抗生素或抗生素浓度低于检出限），观察要迅速，避免光照过久出现干扰[5]。

2 结果与分析

2.1 国标法检测结果

按照国标法对加标样品进行测定，结果见表2。

表2 国标法加标样品检测结果表

由表2 可知，阳性对照结果为阳性，阴性对照结果为阴性，表明该检验过程有效，不存在外在污染。加标样品检出阳性结果的最低加标浓度即为加标抗生素（青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素）的最低检出限[6]。结合表1、表2 结果，常见抗生素的最低检出限分别为青霉素30 μg·L-1、链霉素5 000 μg·L-1、庆大霉素3 000 μg·L-1、卡那霉素5 000 μg·L-1。实验结果表明按照GB/T 4789.27—2008 检验常见抗生素的最低检出限高于国标中最低检出限，检验方法的灵敏度低。

2.2 方法优化

2.2.1 原因分析

常见抗生素的最低检出限过高可能是嗜热链球菌添加量过大，所添加的低浓度抗生素无法完全抑制嗜热链球菌的增殖，从而显示阴性。

2.2.2 解决方案

为了检出低浓度的抗生素残留，对检验方法进行优化。配制添加国标最低检出限浓度的青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素标准溶液的加标样品，作为样品中抗生素残留量，通过调节嗜热链球菌添加量来验证检出浓度。

2.2.3 实验方法

（1）测试菌液制备。将经活化的嗜热链球菌菌株接种到9 mL 灭菌脱脂乳中，置于36 ℃生化培养箱中培养15 h，取1 mL 培养液加入9 mL 灭菌脱脂乳，混匀成为测试菌液，备用。

（2）样品准备。①样A：100 mL 容量瓶中加入1.0 mL 0.3 mg·L-1青霉素标准溶液，用鲜乳样品定容至刻度，制成青霉素残留浓度为3.0 μg·L-1的加标样品。②样B：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5.0 mg·L-1链霉素标准溶液，用鲜乳样品定容至刻度，制成链霉素残留浓度为50 μg·L-1的加标样品。③样C：100 mL 容量瓶中加入1 mL 3.0 mg·L-1庆大霉素标准溶液，用鲜乳样品定容至刻度，制成庆大霉素残留浓度为30 μg·L-1的加标样品。④样D：100 mL 容量瓶中加入1 mL 5 mg·L-1卡那霉素标准溶液，用鲜乳样品定容至刻度，制成卡那霉素残留浓度为50 μg·L-1的加标样品。

（3）样品处理及培养。分别取2.2.3（2）样品各9 mL于试管中，每份样品取10 份，同时再做阴性对照（9 mL灭菌脱脂乳）和阳性对照（9 mL 0.006 IU·mL-1青霉素G 参照溶液）各5 份，所有试管置于80 ℃水浴加热5 min，冷却至37 ℃以下，分别加入50 μL、100 μL、300 μL、500 μL、1 mL 测试菌液，轻轻混匀试管，36 ℃水浴2 h，加4% TTC 水溶液0.3 mL，涡旋混匀，36 ℃避光水浴培养30 min，观察颜色变化，如颜色没有变化，于36 ℃避光水浴中继续培养30 min 作最终观察，观察要迅速，避免光照过久出现干扰。

2.3 优化方法的结果与分析

方法优化后，按照国标添加量1 mL 的0.05 倍、0.1 倍、0.3 倍、0.5 倍和1.0 倍添加不同量测试菌液，检验结果见表3。

表3 添加不同量测试菌液检验结果表

由表3 可知，当加50 μL 测试菌液时，阴性对照检测结果为阳性，实验失败。而当加100 μL 测试菌液时，加标样品均能检出阳性，阴性、阳性对照符合要求。当测试菌液加量后均检出阴性结果。当添加菌量为100 μL 时，常见抗生素的最低检出限分别为青霉素3.0 μg·L-1、链霉素50 μg·L-1、庆大霉素30 μg·L-1、卡那霉素50 μg·L-1。表明可以通过适当减少嗜热链球菌的添加量来提高该检验方法的灵敏度。

3 结论

上述实验结果表明，按照GB/T 4789.27—2008 检验方法的灵敏度低，可以通过适当减少嗜热链球菌的添加量来提高该检验方法的灵敏度。