不同乳酸菌固态发酵对黑水虻幼虫营养价值的影响

2024-01-17郭建来魏红芳姬向波翟乐平

中国饲料 2024年1期

郭建来，和月，魏红芳，刘昆，姬向波，翟乐平

（1.河南牧业经济学院河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南郑州 450045；2.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450045；3.河南同发生物科技有限公司，河南郑州 450000）

黑水虻是最近几年昆虫资源领域研究的热点之一，随着黑水虻幼虫资源化处理餐厨垃圾和畜禽粪便的广泛推广，黑水虻幼虫饲料化的应用技术也被重点关注和研究（郝建伟等，2022）。目前，黑水虻幼虫主要采取微波烘干的加工方式，也有文献报道了黑水虻虫粉替代蛋白原料在畜牧业中的应用（Park 等，2021；赵燕等，2021；Gariglio 等，2021；Rawski 等，2020；张金金等，2020；Chia 等，2019；Pieterse 等，2019；张放等，2018；陈巍等，2017），但微波烘干方式成本过高，严重限制了黑水虻幼虫在畜牧生产中的应用。进一步探讨黑水虻幼虫的加工工艺是未来黑水虻幼虫饲料化的研究方向之一（王斌等，2021）。近年来微生物发酵饲料在畜牧业中得到了广泛应用，其不仅可以改善肠道健康，提高机体免疫力，还能减少抗生素的使用（杨连玉等，2018）。然而，迄今为止，微生物发酵饲料主要是以植物性农副产品为主要原料，利用黑水虻幼虫生产功能性发酵饲料鲜有报道。本试验选择3 种乳酸菌对黑水虻幼虫进行固体发酵，着重对黑水虻幼虫发酵前后各营养成分的变化进行分析，筛选出适宜的乳酸菌发酵剂，为黑水虻幼虫的固体发酵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料黑水虻幼虫和麸皮由郑州普恩科技有限公司提供，植物乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌为本实验室保藏，MRS 培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 试剂硫酸铜和硫酸钾（分析纯）：购自天津凯通化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：购自天津市永大化学试剂有限公司；硫酸（分析纯）：购自天津市致远化学试剂有限公司；葡萄糖：购自山东祥瑞药业有限公司；硼酸（分析纯）：购自天津市恒星化学试剂制造有限公司；石油醚（60 ～90 ℃）和氢氧化钠（分析纯）：购自四川西陇科学有限公司；乳酸对照品：购自北京索莱宝科技有限公司；乙腈和甲酸（色谱纯）：购自Thermo Fisher 公司；氨基酸对照品及氨基酸检测试剂：购自德国曼默博尔公司青岛技术服务中心。

1.3 主要仪器精密pH 计（型号Seven compact）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；磁力搅拌器（型号HJ-1）：常州越新仪器制造有限公司；恒温培养摇床（型号THZ-100）、隔水式培养箱（型号GHP-9160）：上海—恒科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（型号K2025）：山东悟空仪器有限公司；超净工作台（型号SW-CJ-1F）：苏州净化设备有限公司；紫外可见分光光度计（型号UV Power）：北京莱伯泰仪器有限公司；凯氏定氮仪（型号K9840）、石墨消解炉（型号SH220F）、粗脂肪测定仪（型号SOX416）：济南海能仪器股份有限公司；电子分析天平（型号BAS224S）：上海精密仪器仪表有限公司；陶瓷纤维马弗炉（DTM-4A-12）、人工气候箱（型号DGC-300-Ⅱ）：上海灯晟仪器制造有限公司；纤维分析仪（型号A220i）：美国安康公司；电热鼓风恒温干燥器（型号GZXGT-400.101-3）：上海跃进医疗器械有限公司；氨基酸分析仪（型号A300）：德国曼默博尔公司；超声波清洗机（型号SB25-12DTD）：宁波新芝生物科技股份有限公司；台式高速冷冻离心机（型号TGL-23）：四川署科仪器有限公司；微机全自动量热仪（型号TYHW-2000 型）：鹤壁市仪器仪表制造有限公司。

1.4 测定方法水分：105 ℃烘箱干燥，GB/T 6435-2014；总能：采用全自动量热仪测定；粗纤维：ANKOM200 纤维分析仪测定，GB/T 6434-2006；粗蛋白质：采用凯氏定氮法，GB/T 6432-2018；钙：采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法，GB/T 6436-2018；总磷：采用分光光度法，GBT6437-2002；氨基酸：采用氨基酸自动分析仪检测，GB/T 18246-2019；乳酸：采用高效液相色谱法，依据T/NAIA002-2020《发酵饲料中乳酸含量的测定》。

多肽含量的测定：准确称取发酵饲料4.00 g，加入三氯乙酸（15%）溶液50 mL，混合均匀，静置5 min，中速定性滤纸过滤，将滤液转移至50 mL离心管，4000 r/min 离心10 min，准确移取上清液10 mL 于消化管中，按全量法粗蛋白质测定方法测定其多肽含量，具体操作和计算参照GB/T 6432-2018。

pH 测定：准确称取发酵后饲料样品10 g，加入90 mL 的生理盐水，将其充分搅拌，使用pH 计测定pH。

1.5 发酵用种子液的制备在无菌环境下，用无菌接种环挑取平板菌落1 ～2 环至其相应的液体培养基中，37 ℃培养12 h，然后按1%的比例将其接种至液体培养基中扩大培养4 h，获得发酵用种子液。

1.6 黑水虻发酵饲料的制作黑水虻幼虫在使用前停止饲喂1 d，准确称取黑水虻幼虫和麸皮，按1:1 混合，然后分别加入发酵用种子液，物料含水量最终控制在40.0% 左右。试验分为4 组，分别为对照组（未发酵）、试验1 组（植物乳杆菌组）、试验2 组（粪肠球菌组）、试验3 组（嗜酸乳杆菌组），每组3 个平行，将混匀后的3 种样品分别装入发酵袋中，进行密封，放于35 ℃人工气候箱中发酵3 d。发酵结束后将样品于105 ℃烘1 h，65 ℃烘4 h，粉碎后过80 目筛，得黑水虻幼虫发酵饲料样品，保存在干燥器中备用。试验地点在河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，试验于2022 年3 ～4 月进行。

1.7 数据处理与分析试验数据用Excel2016 软件进行初步处理后，采用SPSS 22.0 软件ANOVA对试验数据进行单因素方差分析，试验数据采用“平均值±标准误”表示，用Duncan's 法进行差异显著性检验，P ﹤0.05 表示差异显著，P ﹤0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料重量的影响由表1 可知，黑水虻发酵饲料经三种乳酸菌发酵后，重量都有一定损失，其中以试验1 组的损失率最低，但三组之间差异不明显（P ＞0.05）。

表1 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料重量的影响

2.2 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料营养成分的影响由表2 可知，与对照组相比，试验1 组、2 组和3 组干物质中粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷等营养成分的含量略有增加，但差异不显著（P ＞0.05）；总能与发酵前相比略有提高，但差异不显著（P ＞0.05）；与发酵前相比，试验1 组、2 组和3 组粗纤维含量显著降低，分别降低了16.25%（P ﹤0.05）、16.41%（P ﹤0.05）和10.54%（P ﹤0.05）。

表2 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料营养成分的影响

2.3 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料氨基酸含量的影响由表3 可知，与对照组相比，经3 种乳酸菌发酵后各试验组氨基酸总和均升高。其中，缬氨酸含量分别增加了11.25%（P ﹤0.05）、10.00%（P ﹤0.05）和16.25%（P ﹤0.05），脯氨酸含量分别增加了15.73%（P ﹤0.01）、13.75%（P ﹤0.01）和8.99%（P ﹤0.01）。

表3 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料氨基酸含量的影响 %

2.4 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料pH和乳酸含量的影响由表4 可知，黑水虻饲料发酵后，各组之间乳酸含量差异极显著（P ﹤0.01），其中试验1 组乳酸含量最高，达到了8.72%；发酵后，各组pH 显著下降（P ﹤0.01），其中试验1 组pH 最低。

表4 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料pH 和乳酸含量的影响

2.5 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料多肽含量的影响由表5 可知，与对照组相比，试验1 组、2 组和3 组多肽含量分别提高了270.59%、266.06%和270.13%，差异极显著（P ﹤0.01）。

表5 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料多肽含量的影响 %

3 讨论

3.1 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料主要营养成分含量的影响益生菌可以将非蛋白氮和无机氮转化为具有较高营养价值的菌体蛋白，使蛋白质含量升高。本试验结果显示，发酵后黑水虻饲料粗蛋白质含量稍有升高。侯楠楠等（2018）使用复合益生菌固体发酵豆粕，发酵后豆粕的粗蛋白质含量增加6.07%；樊振等（2014）利用植物乳杆菌对青贮玉米进行了发酵，发酵后其粗蛋白质含量也有所升高；魏一星等（2014）采用植物乳杆菌对小麦胚芽进行发酵试验，发现其粗蛋白质、氨基酸含量均提高。缬氨酸作为动物体内的一种必需氨基酸，能改善仔猪生长性能和免疫功能，并提高泌乳母猪的泌乳能力（陈熠等，2014）；脯氨酸可参与细胞的增殖和分化，能够促进胎儿与仔猪的生长发育（陈秋萍等，2017），黑水虻饲料发酵后其缬氨酸和脯氨酸的含量都显著提高。

粗纤维具有促进肠道蠕动的作用，但也是饲料中最难消化的一种营养物质。章世元等（2009）研究发现，豆粕发酵后粗纤维含量下降了43.73%；税朝毅等（2013）用益生菌发酵白酒丢糟，发酵产物的粗纤维含量大幅下降。本试验结果显示，黑水虻饲料经3 种乳酸菌发酵后粗纤维含量明显下降，与前人的试验结果一致。

3.2 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料pH和乳酸含量的影响乳酸菌在发酵过程中，可以通过产生一定的酶，将葡萄糖、乳糖等物质转化为乳酸等有机酸，从而使饲料的pH 下降，同时还能保持动物肠道菌群的平衡，减少腹泻。王诚等（2022）对地源性优势青贮发酵乳酸菌进行了研究，结果表明，乳酸菌在青贮中能产生大量的乳酸，从而使其pH 下降，有利于青贮饲料的长期保存；王赫等（2017）利用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵由玉米、菜籽粕、棉籽粕组成的混合饲料，发酵后乳酸菌和乳酸含量均显著高于未经发酵的饲料。本试验结果显示，黑水虻饲料经3 种乳酸菌发酵后乳酸含量显著增加，pH 显著降低，其中植物乳杆菌固态发酵黑水虻饲料效果较优。

3.3 不同乳酸菌固态发酵对黑水虻发酵饲料多肽含量的影响多肽作为功能性饲料，具有促生长、减少腹泻、调节免疫力、刺激动物食欲、增强抗菌和抗病毒能力的功能（陈伟，2011）。吝常华等（2018）对豆粕固态发酵工艺进行优化，豆粕经混合菌发酵后，小肽含量较未发酵组提高了8.68倍；林俊宏等（2017）通过试验优化发酵鱼粉的工艺，使得发酵豆粕中小肽含量提高25%以上；任晓静等（2013）的试验表明，花生粕经微生物发酵后多肽含量显著提高。本试验结果表明，经3 种乳酸菌固态发酵后，黑水虻发酵饲料中的多肽含量均显著升高（P < 0.01），其中以植物乳杆菌组多肽含量最高。