复方中草药四味穿心莲益生菌发酵产物对鸡大肠杆菌作用

2024-01-17单文琪江庆国张述阳谭艳平周铁忠王宏军

中国饲料 2024年1期

单文琪，江庆国，张述阳，3，谭艳平，周铁忠，王宏军

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001；2.大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连 116036；3.沈阳沈化院测试技术有限公司，辽宁沈阳 110141）

复方中草药四味穿心莲方剂源自《中华人民共和国兽药典》（2020 版）二部收录的四味穿心莲散，由穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶4 味中草药组成，主治仔猪、雏鸡的大肠杆菌病。汪艳秋等（2013）用高效液相色谱法（HPLC）对四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯进行含量测定，陶松若等（2020）研究了四味穿心莲散及其组分对沙门菌的体外抑菌效果，姜煜倩等（2021）建立了同步检测四味穿心莲散中绿原酸和芦丁的HPLC 方法，张利勃等（2023）考察了四味穿心莲散水煎剂对禽致病性大肠杆菌的体内外抗菌活性。益生菌发酵中草药可以促进中草药化学成分的溶出。研究表明，中草药发酵产物对益生菌和动物机体都有着良好的互作关系，可以改善猪鸡肠道环境，促进药物吸收，进而提高生物利用度及其疗效（陈柯源，2020）。本试验考察了自制复方中草药四味穿心莲益生菌发酵产物（FPSCS）体外抗菌活性及其对SPF 雏鸡人工感染大肠杆菌病的临床疗效。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器穿心莲、辣蓼、葫芦茶、大青叶购自安徽亳州中草药饮片有限公司；α-肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、γ-干扰素（IFN-γ）ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；硫酸新霉素、O2型鸡大肠杆菌由大连三仪动物药品有限公司提供；益生菌由临朐一鸣饲料有限公司馈赠；复方中草药四味穿心莲益生菌发酵产物（FPSCS）由锦州医科大学动物药学实验室提供；恒温培养箱购自北京金北德工公司；双人单面超净工作台购自苏州净化设备有限公司；SPF 鸡隔离器购自苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

1.2 药液制备取自制FPSCS 离心后的上清液，旋转蒸发仪浓缩至相当于生药1 g/mL，作为体内抗菌活性试验药液，高压灭菌后的药液作为测定体外抗菌作用药液。

1.3 菌悬液的制备用徐淑云等（1994）提出的活菌计数调整细菌浓度，采用Jiang 等（2013）提出的微孔-平板法测定FPSCS 对试验菌株的MIC和MBC，每组试验重复3 次。

1.4 半数致死量的确定采用改良寇氏法测定O2型鸡大肠杆菌的半数致死剂量（LD50）（沈建忠，2022），按表1 分组，每只SPF 雏鸡（济南斯派福瑞生物公司）腿肌注射0.1 mL 试验菌液，放入SPF 隔离器中饲养观察（SPF 鸡所用饲料购自北京科澳协力饲料有限公司），记录死亡动物数，按公式计算试验菌株的LD50。

表1 半数致死量分组

1.5 动物试验设计取28 日龄健康的SPF 雏鸡，以1.4 获得的LD50腿肌注射试验菌液制备病理模型，随机分6 组，每组30 只，另设健康对照组，按表2 进行给药，观察和记录试验动物的临床表现；统计治愈率、无效率、总有效率（张瀚元，2018）。

表2 分组及给药方法

1.6 炎症因子的检测在给药后的第2、7 天，每组随机选取3 只雏鸡颈静脉采血2 mL，析出血清后按照ELISA 试剂盒说明书检测样品中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6 炎症因子的含量。

1.7 统计分析通过SPSS 26 版软件对总有效率、治愈率、炎症因子含量进行单因素方差分析，P < 0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 MIC 和MBC 的测定结果 FPSCS 对O2型鸡大肠杆菌体外抑菌活性结果见图1，其MIC 和MBC 均为31.25 mg/mL。

图1 MIC 和MBC 的测定结果

2.2 肌内注射O2型鸡大肠杆菌的LD50将表3相关数值代入LD50计算公式中，即得在SPF 雏鸡腿肌注射O2型鸡大肠杆菌LD50为1.94×109cfu/mL，标准误差Sx50为0.16，95%可信限为9.42×108~4.00×109cfu/mL。

表3 SPF 雏鸡腿肌注射O2 型大肠杆菌的急性毒性试验结果

2.3 治疗结果给药3 h 受试动物仍表现精神沉郁，6 h 受试动物排黄白色稀粪；给药治疗2 d后，高、中、低剂量组受试动物出现明显好转，3 d后精神状态良好，采食饮水恢复正常。各组治疗效果如表4 所示，FPSCS 各剂量组间的治愈率、总有效率均无显著性差异（P > 0.05），FPSCS 高剂量组的治愈率显著高于硫酸新霉素组（P < 0.05），极显著高于四味穿心莲散组和益生菌组（P < 0.01）；FPSCS 各剂量组的总有效率均显著性高于四味穿心莲散组和益生菌组（P < 0.05）。

表4 各试验组治疗效果%

2.4 炎症因子的含量如图2 所示，给药第2天，FPSCS 高、中、低剂量组血清中的IFN-γ 含量显著高于硫酸新霉素组、四味穿心莲散组、益生菌组和攻毒对照组（P < 0.05），略低于健康对照组（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低剂量组血清中的IL-1β 含量显著低于四味穿心莲散组、硫酸新霉素组、益生菌组和攻毒对照组（P < 0.05），与健康对照组相当（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低剂量组血清中的IL-6 含量显著低于四味穿心莲散组、硫酸新霉素组、益生菌组和攻毒对照组（P < 0.05），与健康对照组相当（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低剂量组血清中的TNF-α 含量显著低于四味穿心莲散组、健康对照组、益生菌组和攻毒对照组（P < 0.05），与硫酸新霉素组相当（P ＞0.05）。用药后第7 天，FPSCS 高、中、低剂量组血清中的IL-6 含量显著高于攻毒对照组（P < 0.05），FPSCS 高、中、低剂量组血清中的IFN-γ 显著高于益生菌组、健康对照组（P < 0.05），而各试验组血清中的IL-1β、TNFα 的含量均无显著性差异（P ＞0.05）。

图2 给药第2 天和第7 天各试验组炎症因子含量

3 讨论

微量肉汤法根据比浊度可以直观地观察判定药物的抑菌作用，但是中草药及其提取物中含有的酸性或碱性化合物可直接与营养肉汤中的蛋白发生反应而出现浑浊现象，所以单一的微量肉汤-比浊法不宜直接作为测定中草药提取物体外抗菌活性的方法，所以本研究选用微孔-平板法测定FPSCS 对O2型鸡大肠杆菌的MIC 和MBC，避免了误判，且抑菌效果实现可视化（如图1 所示），此方法判定更精准与Jiang 等（2013）报道的一致。存活率、治愈率、总有效率及无效率能宏观地反映出受试药物对试验群体的状况，是评价药物临床应用价值的重要指标之一（张瀚元，2018）。由表4 可知，FPSCS 高、中、低剂量组对鸡大肠杆菌病的治疗有效率和治愈率略高于张明悦（2022）的报道，低剂量组的治愈率高于张玥等（2021）的研究结果，由此表明，FPSCS 可以有效提高鸡大肠杆菌病的治愈率和总有效率，具有一定的临床应用价值。由图2 可知，FPSCS 可以显著降低患病雏鸡血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量（P < 0.05），显著提高患病雏鸡血清中抑炎因子IFN-γ 的含量（P < 0.05）。其中TNF-α 是炎症主要效应因子，在介导早期炎症过程中发挥重要作用（Hammam 等，2013）。IL-1β是促炎性细胞因子，大量的IL-1β 会引起广泛的炎症反应。 IL-6 具有促炎作用，但过量的IL-6可能会诱发炎症风暴（李东薇等，2020）。在感染的早期，IFN-γ 具有免疫调节、促进T 淋巴细胞增殖和分化等功能（张珂鑫，2022）。基于此，FPSCS 能够提高患病雏鸡的免疫功能，抑制早期炎症水平，诱发抗炎反应，维持免疫平衡，有利于保护试验鸡群平稳过渡急性攻毒期，从而治疗鸡大肠杆菌病。