大豆凝集素对兔小肠组织的氧化应激与炎症因子的影响

梅胜尧， 张逸民， 高庆发， 张玉堂

（江苏省药物研究所有限公司江苏省药物安全性评价中心，江苏南京 210018）

大豆因其营养价值高被广泛应用于食品和饲料行业，但在实际应用过程中，由于大豆中存在抗营养因子，在很大程度上限制了其使用。大豆凝集素作为主要的抗营养因子之一， 对胃肠道具有严重的不良影响，例如影响胃肠道消化酶，且因其独特的化学结构性质，大豆凝集素可与肠上皮结合，造成肠道黏膜的结构破坏（Zhao 等，2011）。 大豆凝集素通过影响整合素α2、α6 和β1， 导致猪肠上皮细胞的周期阻滞， 进而介导抗肠细胞增殖的作用（Pan 等，2017）。 此外，食用大豆凝集素还会导致机体其他组织器官的损伤， 如导致大鼠体内脂质耗竭，造成小肠和胰腺过度生长，在饲喂大豆凝集素的大鼠中还观察到脾脏和肾脏生长不良（Zang 等，2006）；随着大豆凝集素剂量的增加，抗体IgG 和IgM 水平也随之下降， 说明大豆凝集素以剂量依赖的方式干扰细胞和体液免疫功能（Tang 等，2006）。 兔既是皮、毛与肉多用的特种经济动物，也是科学研究过程中的实验动物。兔的肠道健康对于兔的养殖要求以及经济价值与科研价值的利用至关重要。已有研究表明，大豆凝集素通过L 型钙通道介导兔空肠细胞分泌胆囊收缩素（Jordinson 等，1998）。分离纯化的兔小肠上皮细胞表面含有大量大豆凝集素靶位点， 增加细胞培养基中的大豆凝集素浓度， 可促进兔小肠上皮细胞增殖，影响细胞成熟分化程度，增大细胞膜的通透性，进而破坏细胞屏障功能（刘飞飞，2011）。此外，日粮添加大豆凝集素影响兔肠道糖基化（车东升和秦贵信，2016）。动物试验表明，大豆凝集素损害了水生动物乌苏里拟鲿的免疫和抗氧化能力，导致炎症反应及其肠道和肝脏中细胞因子的异常表达（Bai 等，2022）。 由此可见，大豆凝集素可损伤兔肠道健康，但其是否影响兔肠道的氧化还原状态以及炎症水平还不清楚。 因此，本试验旨在探究大豆凝集素对新西兰白兔肠道组织的氧化应激指标以及炎性细胞因子的影响，为探明大豆凝集素在兔养殖生产与科学研究中的影响提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 参考Zang 等（2006）的方法，通过亲和层析法制备纯化的大豆凝集素， 即经过（10%，m/V） 石油醚脱脂处理后用磷酸盐PBS 提取，48 ℃条件下持续搅拌，48 ℃下离心取上清液，加入固体硫酸铵达到85%的饱和度使提取物沉淀，将沉淀物重新溶解在磷酸盐缓冲液中，采用透析法去除硫酸铵杂质，透析液过柱，采用含D-半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱， 大豆凝集素的洗脱液用蒸馏水透析， 然后冷冻干燥并在48 ℃下备存。经过大豆凝集素的酶联免疫吸附试验（ELISA）分析，大豆凝集素得率为0.96%。

1.2 试验饲粮 参考蔡景义等（2022）的新西兰白兔饲养标准配制基础饲粮， 基础饲粮的主要组成原料为玉米、豆粕、甜菜粕、小麦麸以及苜蓿草粉等，基础饲粮为直径约2.5 mm 的颗粒状，饲粮组成与营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理 试验兔饲养于标准兔笼中，按照每2 只/笼的密度进行饲养，12 h 光照与12 h 黑暗，自然通风，舍内温度（22±3）℃，相对湿度40%~ 70%。 自由采食，自由饮水，并按常规免疫接种。

1.4 试验设计 选取健康的35 日龄断奶新西兰白兔30 只，体重为（725.45±20.10）g，随机分为3组，每组10 只。0 mg/kg 大豆凝集素组的兔灌胃生理盐水，17.5 mg/kg 与87.5 mg/kg 大豆凝集素组的兔分别按17.5、87.5 mg/kg 的剂量灌胃大豆凝集素。试验期10 d。试验结束后，腹腔注射过量麻醉处死，立即打开腹腔，分别取出小肠组织，按十二指肠、空肠以及回肠进行节段分离， 所有样品装入密封口袋，标记，即刻放入-80 ℃冰箱保存，备用。

1.5 指标测定

1.5.1 氧化应激指标的测定 将备存的兔十二指肠、空肠、回肠样品，在预冷的生理盐水中洗去肠道内容物，剪碎，加入PBS，在低温超速匀浆机中匀浆，离心后分离上清液。每个样本取一部分上清样品，先采用BCA 蛋白测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）进行蛋白浓度测定；同时取另一部分上清样本，采用商品化生化测定试剂盒（南京建成生物工程研究所） 按照厂家说明书要求测定小肠T-AOC、SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量。

1.5.2 炎症因子的测定 按照1.5.1 的方法制备待测样本上清液， 先取一部分上清样品进行蛋白浓度测定，再取另一部分上清样本，采用酶联免疫吸附测定（ELISA） 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司） 按照厂家说明书要求测定小肠TNF-α、IL-6 以及IL-1β 含量。

1.6 数据统计与分析 试验结果表示为 “平均值±标准误（SEM）”。 运用IBM SPSS Statistics 24软件进行单因素方差（One Way ANOVA） 分析，并用LSD 进行事后检验，比较组间数据差异。P <0.05 表示差异显著，P ＞0.05 表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大豆凝集素对兔小肠组织氧化应激的影响 由表2 可见， 与0 mg/kg 大豆凝集素组相比，87.5 mg/kg大豆凝集素组兔十二指肠、空肠及回肠的T-AOC能力分别降低了31.96%、49.27%、36.35%，MDA含量分别显著升高了217.84%、132.46%、74.29%（P < 0.05）。 与0 mg/kg 大豆凝集素组相比，87.5 mg/kg 大豆凝集素组兔十二指肠、 空肠的SOD 活性分别降低了22.05%、45.51%（P < 0.05）。 另外，87.5 mg/kg 大豆凝集素组兔空肠和回肠的GSHPx 活性显著低于0 mg/kg 大豆凝集素组， 分别降低了36.73%、29.69%（P < 0.05）。 17.5 mg/kg 大豆凝集素组兔的十二指肠、 空肠和回肠的T-AOC、SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量与0 mg/kg 大豆凝集素组无显著性差异（P ＞0.05）。

表2 大豆凝集素对兔小肠组织氧化应激的影响

2.2 大豆凝集素对兔小肠组织炎性因子的影响由表3 可见，与0mg/kg 大豆凝集素组相比，87.5mg/kg大豆凝集素组兔空肠的IL-6 含量显著升高了21.12%（P < 0.05），17.5 mg/kg 和87.5 mg/kg 大豆凝集素组兔回肠的TNF-α 含量明显增加 （P <0.05）， 分别增加了55.23%、65.73%。 17.5 mg/kg 和87.5 mg/kg 大豆凝集素对兔十二指肠的TNF-α、IL-6 与IL-1β 含量没有显著影响（P ＞0.05）。87.5 mg/kg大豆凝集素组兔回肠中的IL-6 以及空肠、回肠中的IL-1β 高于0 mg/kg 大豆凝集素组，但无显著性差异（P ＞0.05）。

表3 大豆凝集素对兔小肠组织炎性因子的影响

3 讨论

3.1 大豆凝集素对兔小肠组织氧化应激的影响活性氧包括超氧化物阴离子、 过氧化氢、 单线态氧、羟基自由基和MDA 等，可通过氧化代谢、线粒体生物能和免疫功能在体内持续产生， 它们参与细胞的进展、生长、死亡和分化（Tan 等，2018）。活性氧是氧化应激中的核心物质。正常情况下，细胞中的氧化还原状态趋于平衡， 然而在细胞遇到外部异常氧化性刺激后， 导致细胞的氧化还原失衡。 在此过程中，大量的活性氧产生，而抗氧化的酶活性受损，导致细胞严重损伤。氧化应激在疾病的发生与发展过程中起着至关重要的作用。 近些年， 动物肠道氧化损伤一直是广受关注的研究热点（Abu 和Hassan，2022；Chen 等，2022；Sundaram等，2003）。 SOD 和GSH-Px 是保护细胞免受ROS损害的关键抗氧化酶。 在肠道中SOD 和GSH-Px等抗氧化酶活性降低， 致使氧化还原信号破坏正常细胞稳态， 摄入的食物和微生物亦可诱导上皮和免疫或炎症细胞的氧化损伤和胃肠炎症反应（Bhattacharyya 等，2014）。SOD 可将超氧阴离子转化为过氧化氢， 然后过氧化氢酶再将之催化为水和氧气，从而消除ROS 并保护细胞免受过氧化氢的损害（Kwon 等，2022；Li 等，2021）。 GSH-Px 是重要的自由基捕获酶之一， 不仅具有清除自由基和衍生物的作用， 还能减少脂质过氧化物的形成（Taysi 等，2019）。 T-AOC 反映了各种抗氧化物质、抗氧化酶等（如抗氧化物酶、维生素C 以及谷胱甘肽等）构成的总抗氧化能力，是体现保护细胞以及组织免受活性氧自由基造成的氧化损伤（Meng 等，2022）。 另外，MDA 是脂质过氧化的产物，该指标可反映脂质损伤程度（Elmaksoud 等，2021）。本研究发现高剂量87.5 mg/kg 的大豆凝集素抑制了兔十二指肠、 空肠及回肠的抗氧化酶活性，并增了肠道组织的膜脂质损伤程度，而低剂量（17.5 mg/kg）的大豆凝集素对兔十二指肠、空肠及回肠的氧化应激程度影响较小。

3.2 大豆凝集素对兔小肠组织炎性因子的影响TNF-α、IL-1β 以及IL-6 属于典型的促炎性细胞因子（Kapoor 等，2011）。 IL-1β 有较强的促炎作用，诱导包括细胞因子、趋化因子等在内多种促炎物质的产生，而且其可通过针对不同细胞发挥广泛的炎症反应，在先天性免疫应答中起重要作用（Weber 等，2010）。 在局部炎性反应中，IL-1β信号放大导致促使黏附因子大量表达，激活淋巴细胞等免疫细胞， 炎症反应程度也被进一步加重。 IL-1β 信号通路的激活在参与促炎反应中发挥着枢纽作用， 因为该信号会继续引起IL-6 的分泌增加， 更进一步激活IL-6 与其受体的级联信号反应。这些促炎因子大量分泌加剧炎性细胞分泌功能的同时损伤组织结构并影响正常的细胞机能。 此外，TNF-α 也是一种常见的促炎细胞因子， 属于TNF 配体超家族的重要成员之一（Zelova 和Hosek，2013）。TNF-α 影响动物机体的发育、免疫等生理功能，包括炎症、脂质代谢和细胞死亡等（Borish 和Steinke，2003）。 TNF-α 参与多种疾病的发生发展， 包括感染性疾病与慢性代谢性疾病等。 本研究揭示了高剂量（87.5 mg/kg）大豆凝集素上调了兔空肠的IL-6 表达， 而17.5 mg/kg和87.5 mg/kg 大豆凝集素均增加了兔回肠的TNF-α 含量；另外，高剂量大豆凝集素仅稍微提高了回肠中IL-1β 的水平。 不同肠段的炎性细胞因子变化不一致， 可能与不同肠段的免疫细胞密度或者大豆凝集素分布的浓度等因素存在差异有关。而且TNF-α、IL-1β 和IL-6 这些因子常受NF-κB 等转录因子信号途径调控 （Hu 等，2020；Yuan 等，2016），推测大豆凝集素可能通过干扰了NF-κB 信号通路影响兔小肠的炎性反应。 另外，已有报道阐述了大豆凝集素可以破坏动物肠道组织结构（冯琳等，2011）。 因此，大豆凝集素也可能是通过破坏小肠黏膜屏障， 导致病原微生物的感染， 引起肠道组织的氧化应激与炎性反应。

4 结论

本试验结果表明，在兔的养殖过程中，摄入过高含量的大豆凝集素可以诱发小肠组织的氧化应激，加重肠道的炎性反应，损害兔的肠道健康。