血清miR-375、miR-155与原发性肝癌临床分期及预后的关系

王根柱 王亦茹 常学忠

作者单位：450000 河南省郑州市第三人民医

原发性肝癌是起源于肝脏上皮或间叶组织的恶性肿瘤,是我国发病率排名第四、死亡率排名第二的癌症类型,其发病受环境、饮食、病毒感染等多种因素影响,有起病隐匿、恶化速度快等特点,患者发病早期多无特异性表现,随癌细胞增殖可逐渐表现肝区疼痛、腹痛、黄疸、发热等症状,此时就诊患者多为中晚期,存在较高预后不良的可能[1]。临床分期是指导原发性肝癌治疗方法选择的重要参考,根据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》指示,我国原发性肝癌分期主要依据全身状况、肝功能、肝外转移、血管侵犯、肿瘤数目、肿瘤大小6个方面分为Ⅰa-Ⅳ期,其中以存在肝外转移的Ⅲb期以后不建议进行手术治疗,因此术前明确患者病理分期具有重要意义[2]。临床原发性肺癌诊断常见甲胎蛋白、超声检查、磁共振成像等检查,虽然临床研究显示存在较高诊断效能,但对疑似患者仍需要经穿刺活检证实或采取,可对患者造成一定创伤。微小RNA(MicroRNA,mi-RNA)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,近年随基因组学发展,越来越多研究人员发现mi-RNA与肿瘤增殖、侵袭能力的关联,同时有报道称mi-RNA在肝硬化发展为肝癌过程中发挥重要作用,提醒其可作为诊断、治疗原发性肝癌患者的生物标志物[3-4]。基于此本研究探讨原发性肝癌患者血清miR-375、miR-155与临床分期及预后的关系,旨在为临床诊疗积累经验。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾我院2016年7月至2021年7月间收治的86例原发性肝癌患者资料,其中男性55例,女性31例;年龄45～76岁,平均(55.12±3.48)岁;肝炎病史25例,肝硬化病史17例;平均甲胎蛋白(874.38±29.76)ng/mL;体力活动状态(performance status,PS)评分:0分13例,1分34例,2分28例,3分10例,4分1例;Child-Pugh肝功能分级:A级34例,B级50例,C级2例;肿瘤数量:单发20例,多发66例;临床分期(china liver cancer staging,CNLC):Ⅰa期5例,Ⅰb期18例,Ⅱa期13例,Ⅱb期15例,Ⅲa期15例,Ⅲb期7例,Ⅳ期13例;所有患者肺癌类型均为肝细胞癌。两组均对研究知情同意。

纳入标准:①年龄>18岁;②符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中诊断标准[2],经病理学检查确诊;③首次确诊;④临床资料完整。排除标准:①活动性肝炎;②合并其他器官系统恶性肿瘤;③入院前接受相关治疗。

1.2 检测方法

入院时取患者外周静脉血5 mL,常温静置30 min,以3000 rpm转速离心10 min分离血清保存至-80 ℃冰箱备用。取500 μL血清利用TRIzol RNA试剂盒提取总RNA,应用分光光度计检测RNA浓度、纯度,结果A260/A280在1.8～2.0判定RNA正常。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA并取2 μg进行实时定量聚合酶链式反应(PCR)扩增,反应参数:94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30s,循环40次,结果利用2-ΔΔCt法计算血清miR-375、miR-155表达量。

1.3 评价指标

①将患者依据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中诊断流程临床分期(Ⅰ～Ⅳ期),统计各分期患者血清miR-375、miR-155表达水平,应用Spearman相关系数做临床分期与血清miR-375、miR-155表达水平相关性分析。②将患者依据是否存在肝外转移分为转移组(临床分期Ⅰa～Ⅲa期)、非转移组(临床分期Ⅲb～Ⅳ期),比较两组患者血清miR-375、miR-155表达水平,应用受试者曲线(ROC)分析诊断临床分期的效能。③将患者依据ROC曲线所得截断值,将患者分为miR-375高表达、低表达,miR-155高表达、低表达,比较不同表达水平患者预后(平均生存时间),采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。④应用COX比例风险模型分析影响患者预后独立影响因素。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同临床分期患者血清miR-375、miR-155表达水平比较

不同临床分期患者血清miR-375、miR-155表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 不同临床分期患者血清miR-375、miR-155表达水平比较

2.2 血清miR-375、miR-155表达水平与临床分期的相关性分析

血清miR-375表达水平与临床分期呈负相关(P<0.05),miR-155表达水平与临床分期呈正相关(P<0.05),见表2、图1、2。

图1 血清miR-375表达水平与临床分期的相关性

图2 血清miR-155表达水平与临床分期的相关性

表2 血清miR-375、miR-155表达水平与临床分期的相关性参数

2.3 血清miR-375、miR-155表达水平诊断肿瘤转移的ROC曲线

转移组血清miR-375表达水平低于非转移组,miR-155表达水平高于非转移组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。血清miR-375、miR-155表达水平及联合诊断肿瘤转移的AUC分为0.898、0.847、0.941,见表4、图3。

图3 血清miR-375、miR-155诊断肿瘤转移的ROC曲线

表3 转移组与非转移组患者血清miR-375、miR-155表达水平比较

表4 血清miR-375、miR-155诊断肿瘤转移的ROC参数

2.4 不同血清miR-375、miR-155表达水平患者预后比较

以ROC曲线所得截断值划分患者血清miR-375、miR-155表达水平高低,其中miR-375高表达49例,低表达37例,miR-155高表达41例,低表达45例。miR-375高表达患者平均生存时间均长于miR-375低表达患者,miR-155高表达患者平均生存时间均短于miR-155低表达患者,差异有统计学意义(P<0.05),见表5,图4、5。

图4 不同血清miR-375表达水平患者的生存曲线

图5 不同血清miR-155表达水平患者的生存曲线

表5 不同血清miR-375、miR-155表达水平患者预后比较

2.5 患者预后影响因素分析

血清miR-375、miR-155表达水平是患者预后独立影响因素(P<0.05),其中miR-375表达水平为独立保护因素,miR-155表达水平为独立危险因素,见表6。

表6 患者预后影响因素分析

3 讨论

原发性肝癌高发病率、高死亡率、预后差的特点是对居民健康的巨大威胁,尽早诊治、及时治疗是挽救患者生命的关键环节。基于生命科学的蓬勃发展,从基因层面诊疗肝癌逐步应用开来,其中mi-RNA近年来受到临床广泛关注。mi-RNA是广泛存在于动植物体内的进化上高度保守且具有良好稳定性的内源性非编码小分子单链RNA,其不仅能参与人体生长发育、调节生命活动,而且有多项报道说明其在恶性肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[5],更有学者认为其可能成为改善肿瘤耐药的新靶点[6]。本研究以原发性肝癌患者为对象探究血清miR-375、miR-155与临床分期,发现二者表达水平与患者临床分期存在关联,提醒miR-375、miR-155参与原发性肝癌疾病发展过程。

miR-375是人染色体2q35区上cryba2和Cadc108基因区域间的片段,有多位学者发现其可在胃癌、食管癌等多种恶性肿瘤中异常表达。在本研究中可见随患者临床分期升高miR-375表达水平逐渐下降,推测其与抑制癌细胞生长相关,次结论在He等[7]动物模型中已有证实,其研究团队将miR-375模拟物结合到肝癌小鼠模型的AEG-1位点发现可抑制肿瘤生长。临床有研究生物信息学筛选出多种参与肝细胞癌进展的核心基因,其中非染色体结构维护凝缩蛋白Ⅰ复合体G亚基(NCAPG)被认为在肝癌细胞中异常高表达,与不良预后直接相关[8],而在Dai等[9]研究中发现miR-375与NCAPG2存在靶向关系,补充miR-375可下调NCAPG2表达水平从而抑制肝癌细胞增殖和迁移且诱导其细胞凋亡。本研究以肝外转移为依据将患者分组比较miR-375表达表达水平,发现二组存在显著差异,证明术前利用血清miR-375检查诊断原发性肝癌患者肝外转移的可能性,据临床诊疗指南建议,肝外转移Ⅲb期以上患者不建议行手术治疗,因此术前检查血清miR-375有助于治疗选择,避免患者额外损伤。此外经生存分析可见,血清miR-375低表达患者平均生存期更短,是患者预后不良的独立影响因素,再次提醒原发性肺癌患者诊疗过程中血清miR-375的应用前景。

本研究结果中显示原发性肝癌患者血清miR-155表达水平与临床分期正相关,考虑其在肝癌细胞增殖迁移中发挥推动作用。miR-155促肿瘤发展最初见于淋巴瘤研究中,发现其过量表达可使外周血CD8+T细胞减少并抑制T细胞受体信号传导,从而推动淋巴瘤进展[10]。在肝脏相关活动中,Wang等[11]研究发现HBeAg可通过诱导巨噬细胞过量表达miR-155,利用其促进炎性细胞因子的产生的机制来加速肝损伤。而乙肝病毒感染引起的免疫反应、慢性炎症正是诱发原发性肝癌的重要危险因素[12],可见miR-155高表达参与的炎症可能推动癌变进程。此外,Xin等[13]研究人员发现miR-155通过抑制肝癌细胞中的H3F3A促进CDK2的磷酸化修饰进而竞争性抑制P21WAF1/CIP1的转录和翻译,达到促肿瘤发生的作用,值得一提的该研究团队发现过量的P21WAF1/CIP1可抵消miR-155的癌变功能,可能成为未来治疗肝癌的方向。本研究结果显示血清miR-155检测存在较高诊断肝外转移的效能,特异度可达95.00%且与miR-375联合诊断可明显提高敏感度至86.36%。而经生存分析显示,血清miR-155高表达是原发性肝癌患者预后不良的危险因素,表达水平更高的患者存在更短的平均生存时间,考虑与miR-155参与肿瘤细胞化疗药物耐药机制相关。虽然miR-155表达与肝癌患者化疗耐药关联的报道较少,但其在其他癌症耐药中的作用报道逐渐增多,胡波等[14]研究显示吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌患者中miR-155表达异常高表达,可能与预后相关。而黄惠敏等[15]发现在急性淋巴细胞白血病患儿中过量的miR-155可通过激活Wnt/β-Catenin信号通路,促进肿瘤细胞增殖,从而抑制凋亡,导致化疗耐药。

综上所述,原发性肝癌患者体内存在miR-375、miR-155异常表达,二者水平与临床分期、预后存在明显关联,可作为治疗前分期诊断生物指标,对后续治疗方法选择存在一定指导意义,疾病管理中监测二者表达水平有助于预后判断。