模拟增温对湿地植物凋落物分解及细菌群落的影响

谢 鹏, 刘国栋,2,*, 孙晋芳,2, 郭 超, 朱开翔, 张晓薇, 王丽丽

1 曲阜师范大学地理与旅游学院,日照 276826 2 南四湖湿地生态环境保护重点实验室,日照 276826

植物凋落物分解是湿地生态系统中的重要过程,对湿地生态系统中的能量流动、物质循环和营养物质平衡起着关键作用[1-3]。凋落物分解受凋落物基质质量、气候等非生物因子以及微生物等生物因子的影响[4-5],这些因子的微小变化都可能直接影响凋落物的分解速率,并对区域甚至全球的碳收支产生影响。微生物是凋落物分解的关键生物因素,它们分泌多种酶,降解凋落物,还参与氨化、硝化、固氮等过程,从而影响植物凋落物的分解过程[6]。通常认为凋落物的分解以真菌为主,细菌次之[7-8],然而细菌在凋落物分解中的作用经常被低估,已有研究表明凋落物分解中的关键细菌群落有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)等,且在凋落物分解过程中会发生一系列演替[9]。一方面,细菌群落会随着湿地植物凋落物的分解发生时间层面上的动态变化[10],另一方面,温度会通过影响细菌的生长发育和分解能力,改变细菌的多样性,进而影响凋落物的分解过程和强度,从而对生态系统的结构和功能产生一系列的变化[11-12]。IPCC第六次气候变化评估结果显示,2001-2020年的全球地表温度相对于1850-1900年增加了1.09 ℃ [0.95-1.20][13]。在全球气候变暖的背景下,中国华北地区的气候出现了明显的暖干化趋势,近65a来平均气温以0.23 ℃/10 a的速率升高[14]。气候变暖可以通过改变湿地生态系统中细菌群落的活性,进而影响植物凋落物的分解过程,并对湿地碳储库功能产生影响[15-16]。因此,研究增温对山东省南四湖湿地植物凋落物分解及细菌群落的影响,对深入了解华北地区生态系统的物质循环过程具有重要的科学意义[17]。

目前湿地植物凋落物的分解研究较多关注湿地植物凋落物表面真菌群落对气候变化的响应,且研究区域主要集中在高纬度或高海拔地区[18],而针对我国华北地区温带湿地湖滨带凋落物分解过程中细菌群落对气候变暖响应的研究较少。因此,我们选择山东省南四湖湿地的典型植物芦苇(Phragmitesaustralis)和香蒲(Typhadomingensis)凋落物进行了一年半的模拟增温实验,旨在分析:(1)在气候变暖的情况下,湿地植物凋落物的分解强度和凋落物基质质量如何变化?(2)在气候变暖的情况下,湿地植物凋落物分解过程中细菌群落的结构和功能如何变化?这些研究有助于科学评价气候变暖对湖泊湿地生态系统物质循环的影响,并为北方湖泊湿地的保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

山东省南四湖(34°30′-35°30′N,116°30′-117°30′E)位于华北平原与黄淮平原交界地带,南北长度为125 km,东西宽度为6-25 km,周围长度为311 km,最大的湖泊面积为1266 km2,总库容为47亿m3。南四湖不仅是我国华北地区最大的淡水湖泊,也是我国南水北调东线工程的重要蓄水区,对维持地区的经济发展和生态平衡,起着十分重要的作用。南四湖属于暖温带半湿润的季风区域,具有雨热交替、降水集中的特点,年平均气温14.2 ℃,年平均降水量700 mm。南四湖湿地湖滨带的典型植物为芦苇(Phragmitesaustralis)、香蒲(Typhadomingensis)等。

1.2 实验设计

2019年9月在南四湖湿地境内微山岛上搭建9套原位增温控制系统OTC(Open-top Chamber)(底面直径0.6 m,高度1.2 m),OTC增温幅度由其顶口直径控制,顶口越小增温幅度越大,9套OTC包括3套增温(2.0±0.5)℃(顶口直径0.4 m)、3套增温(4.0±0.5)℃(顶口直径0.3 m)和3套对照(顶口直径0.6 m)。另外,实验期间的(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃增温为全年平均增温,用数据记录器每小时记录一次OTC内外的大气温度。2019年10月采集芦苇、香蒲2种植物凋落物,在实验室避光自然风干1个月后,分别称取10 g植物组织制作成凋落物样品,放入20 cm×15 cm规格的凋落物分解袋中。凋落物袋网孔大小为0.01 mm,只允许微生物进出网袋。每套原位增温控制系统OTC中放入24袋凋落物,9个处理组共计216袋,其中,162袋凋落物测定凋落物基质质量特征,54袋凋落物测定细菌群落结构特征。凋落物袋用尼龙线系在OTC内的竹竿上加以固定,将竹竿插在实验池的底泥中,使凋落物袋悬浮在水下10 cm处,观测周期为1.5 a(2019.11-2021.5),每两个月(共9次野外采样)取回18袋凋落物进行凋落物基质质量特征测定;另外,分别在2019年11月、2020年5月和2021年5月(共3次野外采样)各取回18袋凋落物进行细菌群落结构特征测定。

图1 本研究的实验设计模式图Fig.1 Model diagram of the experimental design of this study对照Control:对照非增温组 Control non-warming group;(2.0±0.5)℃:增温(2.0±0.5)℃组 Warming(2.0±0.5)℃ group;(4.0±0.5)℃:增温(4.0±0.5)℃组 Warming(4.0±0.5)℃ group

1.3 测定项目与方法

取回的部分凋落物样品经净化去除泥土等杂质后,在实验室避光自然风干,然后放入65 ℃的烘箱中烘干至恒重。使用电子天平称重并记录质量,随后,将样品粉碎后过100目筛,用于总碳(Total Carbon)、总氮(Total Nitrogen)、总磷(Total Phosphorus)、纤维素(Cellulose)、木质素(Lignin)的测定分析。用重铬酸钾-浓硫酸氧化方法测总碳,用凯氏氮气定量分析方法测总氮,用钼-锑抗比色分析方法测总磷。采用经典VanSoest法测定植物组织中的酸性洗涤纤维ADF和酸性洗涤木质素ADL,然后根据以下公式计算木质素和纤维素的百分比:木质素=%ADL,纤维素=(%ADF-%ADL)[19]。

另一部分凋落物保存在-80 ℃冰箱中,用于微生物群落结构和功能活性的分析。利用快速DNA自动提取试剂盒提取细菌DNA,完成基因组DNA抽提后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。对样品进行细菌16SrRNA基因的PCR扩增,针对细菌16SrRNA的V5-V7区域,PCR扩增所用的引物为799 F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193 R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)。将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量,之后按照每个样本的测序量要求,进行相应比例的混合。使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit试剂进行文库构建,委托上海美吉生物(Majorbio)医药技术有限公司进行Illumina MiSeq测序。生成的原始序列数据已存入NCBI数据库,生物工程编号为PRJNA938606。

1.4 数据处理与分析

用累积系数(NAI)表示总碳、总氮、总磷、木质素、纤维素的含量变化,以判断养分总碳、总氮、总磷、纤维素和木质素在分解过程中的积累与释放[20]:

(1)

式中:M0为凋落物的初始质量(g);Mt为凋落物分解时间内的剩余质量(g),Xt为t时间取样的凋落物总碳、总氮、总磷、纤维素和木质素的浓度,X0为初始放样时间的凋落物总碳、总氮、总磷、纤维素和木质素的浓度。

利用指数模型计算分解常数K[21]:

Mt/M0=e-Kt

(2)

式中:M0、Mt含义同公式(1),t为分解时间(a)。K为分解常数,表示凋落物的分解速率。

凋落物分解的温度敏感性用Q10表示,其计算方法为[22]:

Q10=(K2/K1)(10/(T2-T1)

(3)

式中:K1和K2表示温度T1(℃)和T2(℃)下的分解速率。

借助Origin、Matlab软件进行数据整理、分析作图,利用SPSS软件对不同增温条件的凋落物分解常数K和温度敏感性Q10进行单因素方差分析(One-Way ANVOA)。在操作分类单元(OTU)信息的基础上,计算细菌群落Chao、Ace、Shannon和Simpson指数,以此评估Alpha多样性。另外,采用共现网络分析揭示细菌群落在不同增温条件下的共生关系。

2 结果与分析

2.1 凋落物分解期间的温度变化

在2019年11月到2021年5月期间,对对照、(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃处理组的年平均气温进行测量。结果显示,与对照组相比,(2.0±0.5)℃组和(4.0±0.5)℃组的年平均增温幅度分别为1.9℃和3.8℃,符合大气增温实验设计要求。在这段时间内,气温呈“W”型变化趋势,对照组、(2.0±0.5)℃组和(4.0±0.5)℃组的最高温度均出现在2020年7月,分别为25.3 ℃、27.9 ℃和28.9℃。对照组和(2.0±0.5)℃组的最低温度出现在2021年1月,分别为2 ℃和4.2 ℃,(4.0±0.5)℃组的最低温度出现在2020年1月,为6.2 ℃(图2)。

图2 凋落物分解期间的温度变化Fig.2 Temperature variation during the decomposition of litter

2.2 凋落物分解过程中分解速率、温度敏感性以及基质质量的变化

2019年11月至2021年5月的实验过程中,不同处理组的凋落物分解常数K存在显著差异(P=0.020<0.05),香蒲-4.0℃组的K值最大(1.45±0.59),而芦苇-对照组的K值最小(0.68±0.36)(表1)。不同凋落物的温度敏感性Q10差异性显著(P=0.004<0.01),芦苇的Q10(4.45±0.08)大于香蒲的Q10(2.54±0.18)。NAI结果显示,香蒲-4.0 ℃组和芦苇-对照组分别表现出最高和最低的总碳、总氮、总磷和纤维素释放量(图3)。同时,芦苇-4.0 ℃组释放了最多的木质素,而香蒲-对照组释放了最少的木质素。此外,(4.0±0.5)℃组和(2.0±0.5)℃组的总碳、总氮、总磷、木质素和纤维素释放量均明显高于对照组,表明气候变暖促进了这些养分的释放。

表1 分解常数K和温度敏感性Q10的方差(平均值±标准差)Table 1 Variance of the decomposition constant K and the temperature sensitivity Q10 (Mean±SE)

2.3 凋落物基质质量、温度与凋落物分解速率的相关分析

相关分析结果表明,整个分解期的分解常数K与木质素/氮和纤维素/氮之间呈现负相关关系,相关系数分别为-0.653和-0.717;与温度之间存在正相关关系,相关系数为0.731。0到300 d期间的分解常数K1与碳/磷、氮/磷和温度之间存在正相关关系,相关系数分别为0.712、0.947和0.897。300 d到540 d期间的分解常数K2与木质素/氮、纤维素/氮和碳/氮之间存在显著的负相关关系,相关系数分别为-0.827、-0.941和-0.978(表2)。

表2 分解常数的皮尔逊相关分析Table 2 The Pearson correlation coefficient of the decomposition constant K

2.4 凋落物分解过程中细菌群落的结构变化

在整个分解期间,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)等是凋落物细菌群落门水平组成中的优势菌群(图4)。变形菌门在2019年11月对照组的芦苇凋落物中的丰度最高,占细菌总数量的88.9%。按照不同的增温处理,变形菌门在对照组的丰度占比最高,为70.6%,其次为(4.0±0.5)℃组(69.8%),(2.0±0.5)℃组(61.7%)。随着时间的推移,变形菌门的丰度呈下降趋势,其丰度占比从73.1%(T2019)下降到68.1%(T2020),再进一步下降到65.6%(T2021)。拟杆菌门在2019年11月对照组的芦苇凋落物中的丰度较低,占细菌总数量的8.9%。按照不同的增温处理,拟杆菌门在(2.0±0.5)℃组的丰度占比最高,为27.7%,其次是对照组(18.9%)和(4.0±0.5)℃组(16.7%)。随着时间的推移,拟杆菌门的丰度呈上升趋势:从T2019到T2020再到T2021,其丰度占比依次为14.0%、21.9%和22.0%。

图4 不同凋落物处理组的门水平细菌群落相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities at the phylum level in different litter-treated groupsA:增温(4.0±0.5)℃ Warming(4.0±0.5)℃;B:增温(2.0±0.5)℃ Warming(2.0±0.5)℃;C:对照 Control;1:芦苇 Phragmites australis;2:香蒲 Typha domingensis;2019:2019年11月 In November, 2019;2020:2020年5月 In May, 2020;2021:2021年5月 In May, 2021

如图5所示,在1.5 a的凋落物分解过程中,细菌群落的Chao、Ace和Sobs 指数在两种凋落物中呈现出相似的趋势,而Simpson和Shannon指数在两种凋落物中有所差异,香蒲的细菌群落多样性高于芦苇的细菌群落多样性。从分解开始(T2019)到分解结束(T2021),细菌群落的Chao、Ace和Sobs指数在分解过程中逐渐增加,而Simpson和Shannon指数在T2021时达到最高点。此外,按照不同的温度处理,从对照组到(2.0±0.5)℃组,再到(4.0±0.5)℃组,细菌群落的Chao、Ace和Sobs指数逐渐增加,而(2.0±0.5)℃组的Simpson和Shannon指数最高。

图5 不同凋落物处理组的细菌群落α多样性指数Fig.5 The alpha diversity index of bacterial communities in different litter-treated groupsT2019:2019年11月 In November, 2019;T2020:2020年5月 In May, 2020;T2021:2021年5月 In May, 2021

2.5 细菌群落结构变化的影响因素

使用冗余分析(RDA)研究细菌群落对环境的响应,将环境条件分为对照组、(2.0±0.5)℃组和(4.0±0.5)℃组。RDA的前两个轴共解释了60.67%的细菌群落变异,其中RDA1和RDA2分别解释了42.21%和18.46%的变异。分析结果显示,丰度居于前五的门水平细菌有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria),其中,拟杆菌门与木质素、木质素/氮呈显著正相关,厚壁菌门与碳呈显著正相关(图6)。另外,温度因素对(2.0±0.5)℃组和(4.0±0.5)℃组的样本产生了比对照组更显著的影响。

图6 凋落物中细菌群落结构的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of bacterial community structure in litter

共现网络用于表示生态系统中不同物种之间的相互作用,包括竞争和互利共生等关系,通过建立不同温度条件下的共现网络,可以预测细菌群落之间的相互作用。结果表明,参与凋落物分解的细菌群落网络在三种温度条件下均主要由共生关系构成,其中,(2.0±0.5)℃组展现出最高的正相关程度,共生关系的正相关比例占据了71.12%(图7),对照组和(4.0±0.5)℃组的正相关比例分别为67.59%和58.42%。(2.0±0.5)℃组的平均聚类系数最高,为1.00,(4.0±0.5)℃组的平均聚类系数高于对照组的平均聚类系数,0.86>0.54(表3)。另外,在三种温度条件下,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)是网络中节点数量最多的菌门。

图7 不同增温条件下的细菌群落共现网络Fig.7 Co-occurrence networks of bacterial communities under different warming conditions

表3 细菌共现网络的拓扑性质Table 3 Topological properties of the bacterial co-occurrence network

3 讨论

3.1 凋落物基质质量对凋落物分解的影响

凋落物基质质量与凋落物分解之间存在很强的相关性,尤其是凋落物中的碳/氮和木质素/氮是分解速率的可靠预测因子[23]。通常认为初始碳/氮、木质素/氮比值低的植物凋落物分解较快[24],其原因在于凋落物中的氮等营养物质能够满足凋落物中细菌的生长和代谢需求,对发挥降解作用的细菌群落活性和组成具有重要的影响[10]。凋落物中可溶性氮浓度越高,就越能满足细菌的生长和代谢需求,从而导致细菌丰度水平的增加,并持续降低分解早期凋落物中的氮含量;而木质素具有难降解性,较高的初始木质素含量会抑制分解进程,并与分解速率呈现显著的负相关关系[25]。在本研究中,不仅木质素会抑制凋落物分解,难分解物质纤维素同样抑制了凋落物的分解,纤维素/氮比值越高的凋落物其分解速率越低。另外,作为细菌生长和代谢不可缺少的营养元素磷在分解早期的快速释放促进了凋落物分解速率的提升。研究发现氮和磷对凋落物分解限制的重要性不同,通常认为氮/磷< 14时受氮限制,氮/磷> 16时受磷限制,14 <氮/磷< 16时受到氮、磷的共同限制[9]。在本研究中,前期分解速率K1与氮/磷存在显著正相关,并且氮/磷> 16,因此,在分解前期,凋落物分解速率主要受磷的限制。

3.2 增温对凋落物分解的影响

增温对凋落物分解速率有显著影响,一般情况下,凋落物的分解速率随着气温的上升而增加[26-28]。崔嘉楠等人发现,增温在分解初期促进了红杉(Larixpotaninii)凋落物的分解,然而随着分解时间的延长,增温对分解后期凋落物分解速率的促进作用不显著[29-30]。在本研究中,相较于对照处理,增温(2.0±0.5)℃和(4.0±0.5)℃处理显著提高了凋落物的分解速率。此外,温度与K1呈现显著正相关,而温度与K2之间则相关性不大。这一发现表明,增温对凋落物的分解具有一定的促进作用,但随着时间的推移,这种促进作用逐渐减弱,其原因可能是分解后期木质素、纤维素等难分解物质的积累[31],另外,增温会增加蒸散作用,从而改变参与分解的微生物群落结构并抑制相关酶的活性,进而导致分解速率减缓[29]。在本研究中,含有高木质素含量的芦苇凋落物具有较高的Q10值,这可以归因于其固有的凋落物化学特性,如高木质素含量以及较低的氮(TN)、钙(Ca)和锰(Mn)等[32]。

3.3 气候变暖对细菌群落的影响

Romani等认为,真菌能够分泌一些催化降解顽拗物质(如木质素等)的酶[33],而细菌只是从真菌外酶降解复杂大分子过程中形成的物质中受益[34],或者为真菌提供电子或必要的微量元素,促进真菌分解凋落物[35],但细菌在凋落物分解中的作用实际上是被低估了。在本研究中,凋落物的细菌优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)等。变形菌门细菌在碳氮代谢中发挥着重要作用[36],而拟杆菌门细菌主要负责硝化过程,破坏复杂的生物大分子,与凋落物木质素和纤维素的分解有关[37]。随着分解时间的推进,拟杆菌门等细菌群落的丰度上升,变形菌门和厚壁菌门等细菌群落的丰度下降,细菌群落中的优势种从偏好多种碳水化合物的微生物转变为主要分解木质素和纤维素的微生物[12]。

细菌群落对气候变暖的响应非常敏感,较小的环境温度变化都会影响细菌群落的结构组成、活性、生物量及胞外酶分泌过程,进而调控植物凋落物分解的整个过程[38]。Zhao等人发现,气候变暖可以通过间接影响细菌丰度和多样性来影响植物的凋落物分解[12]。在本研究中,增温导致细菌群落的丰度和多样性增加,尤其是增加了拟杆菌门细菌的物种丰度,进而促进了凋落物中木质素和纤维素的降解。细菌共现网络中的正相关代表共生关系,而负相关代表竞争关系,细菌间的共生关系意味着某一区域内有一个完整的细菌群落,并且细菌种类间缺乏竞争[39]。在本研究中,增温不仅提高了细菌共现网络中的正相关比例,而且使得平均聚类系数也有所增加,这意味着气候变暖不仅改善了细菌之间的共生关系[22],而且使得细菌群落之间的连接越来越紧密,细菌群落之间的信息交流越来越多[40]。因此,气候变暖增加了细菌共现网络的复杂性,从而加快了植物凋落物的分解进程,进而影响了湿地生态系统的碳收支平衡。

4 结论

南四湖湿地是一个重要的碳汇,其植物凋落物的分解与存留是碳汇功能的基础。本研究揭示出南四湖湿地湖滨带典型植物凋落物分解受凋落物基质质量、大气温度和细菌群落的综合影响,表明气候变暖会显著促进南四湖湿地植物凋落物的分解,其中细菌与凋落物基质质量具有密切关联,凋落物分解的细菌网络主要由共生关系构成,而增温有助于改善细菌之间的正相关和共生关系。可以预见,未来气候变暖将进一步促进南四湖湿地植物的凋落物分解,并对湿地生态系统的物质循环和碳汇功能产生影响。然而,由于湿地生态系统中植物物种的多样性和生境的复杂性,未来气候变暖对湿地生态系统碳汇功能的影响具有复杂性和不确定性,相关作用机制需要进一步研究。