HPLC法测定反应液中7-氨基头孢烷酸的残留

＊赵玉娟 魏宝军* 贾金焕 马苏杰 张建丽

（1.华北制药河北华民药业有限责任公司 河北 052165 2.抗生素酶催化与结晶技术国家地方联合工程实验室 河北 052165 3.河北省头孢类药物制备技术创新中心 河北 052165 4.华北制药河北华民药业有限责任公司河北省企业技术中心 河北 052165）

头孢菌素类抗生素是一类重要的抗菌药物，抗感染效果较好，在市场中占较大比重。到目前为止，全球头孢菌素类抗生素已拥有70多个品种，已广泛应用于临床治疗当中。它是一种分子中含有头孢烯的半合成抗生素，是β-内酰胺类抗生素中的7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的衍生物，属于β-内酰胺类抗生素[1-2]。头孢菌素类抗生素具有以下优点：对细菌的选择作用强，但对人几乎没有毒性；可破坏细菌的细胞壁，并且在繁殖期杀菌；具有抗菌作用强、抗菌谱广、耐青霉素酶、过敏反应较青霉素类少等[3]。

7-ACA是7-氨基头孢烷酸的简称，是一种重要的生物碱类药物，是半合成抗头孢类药物的重要中间体，在医药制造和医药领域中具有广泛的应用。以7-ACA作为母核与不同的物料反应，可以合成头孢呋辛、头孢唑林、头孢克罗、头孢哌酮钠、头孢吡肟、头孢拉定、头孢曲松钠等头孢菌素类抗生素产品。

杂质是药品的关键质量属性之一，在药品生产过程及储存期间都有可能产生，其对药品的安全性、可靠性、有效性造成潜在影响，故杂质控制研究是一项浩大的工程，是药品质量研究的主要内容。在《中国药典》2020版第四部通则的《9102 药品杂质指导原》及ICH Q3A中均指出起始物料是有机杂质之一，而作为头孢菌素类抗生素产品母核的7-ACA的残留量也影响着药品质量。故在合成工艺过程中控制7-ACA残留含量，可以更好地提高产品的质量。

1.实验部分

(1)仪器与试药

仪器：安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）、岛津LC-20AB型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、XS105DU电子天平（精度0.01mg，瑞士梅特勒-托利多公司）、FE20 pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）。

试药：7-氨基头孢烷酸（7-ACA）对照品（批号130538-200902，含量96.9%，中国食品药品检定研究院）。二水和磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、盐酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；水（去离子水）。

(2)色谱条件

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱（迪马Diamonsil C18 4.6×250mm，5μm或能效相当），流动相为磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈-水（V:V:V=100:60:840），检测波长为254nm（UV），流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为20μl。

(3)测定过程及计算方法

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液滤液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。反应液中7-ACA残留量的计算公式如下：

式中：m对照品—对照品的重量（mg）；P对照品—对照品的含量（%）；A对照品—对照品溶液的主峰面积；N对照品—对照品溶液的稀释倍数。

式中：f平均—对照品溶液校正因子的平均值；A供试品—供试品溶液中7-ACA峰面积；N样—供试品溶液的稀释倍数。

(4)溶液制备

空白溶液：

a.流动相过滤，进样。b.纯化水过滤，进样。

7-ACA对照品贮备液：

精密称取对照品约30mg，置100ml量瓶中，用磷酸盐缓冲液溶解后，再用此缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为7-ACA对照品贮备液。

7-ACA对照品溶液：

精密移取对照品贮备液1.0ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤。

供试品溶液：

量取反应液适量，精密移取，置含有少量有机溶剂的50ml量瓶中，依次加入10%盐酸溶液、纯化水、10%碳酸氢钠溶液各适量，缓慢振摇使反应，再加纯化水稀释至刻度，摇匀，过滤。

加标供试品溶液：

精密移取7-ACA对照品贮备液0.8ml，置25ml容量瓶中，再用已制备的供试品溶液稀释至刻度，摇匀，过滤。

2.结果

(1)专属性试验

精密移取空白溶液、对照品溶液、加标供试品溶液、供试品溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，对色谱图进行分析图1。由实验结果可知，空白溶液对7-ACA残留量检测无明显干扰，供试品溶液和加标供试品溶液中7-ACA峰保留时间（分别为8.013min、7.989min）与对照品溶液的主峰保留时间（8.037min）一致，对照品溶液、供试品溶液和加标供试品溶液中7-ACA峰纯度因子分别为999.987、992.772、999.831，均大于990，说明峰纯度良好；供试品溶液和加标供试品溶液中7-ACA峰与其前后相邻峰分离度均大于1.5，符合要求，说明该测定7-ACA残留量分析方法专属性良好。实验数据见表1。

图1 典型色谱图

表1 专属性结果

(2)检测限和定量限

精密移取对照品溶液逐级稀释，配制低浓度溶液，按“1.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图，主峰信噪比大于3时为检测限，信噪比大于10时为定量限。试验测得7-ACA检测限浓度为52.12ng/ml；定量限浓度为173.72ng/ml。配制6份定量限浓度的溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，主峰峰面积的RSD为2.0%，主峰保留时间的RSD为0.04%。

(3)线性试验

取适量7-ACA对照品，精密称定，置100ml容量瓶中，用适量磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解，再用此缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为7-ACA对照品贮备液；精密移取7-ACA对照品贮备液，进行不同倍数的稀释制得浓度分别为2.895μg/ml、4.343μg/ml、5.791μg/ml、7.238μg/ml、9.555μg/ml、11.582μg/ml的溶液，作为对照品的线性溶液。精密量取上述各线性溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录主峰面积。以对照品溶液的浓度（C，μg/ml）为横坐标，测得各溶液的主峰面积（A，mAU）为纵坐标进行线性回归方程。由实验得7-ACA回归方程：A=27.333C+2.7421。实验结果表明，7-ACA在2.895～11.582μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系（100%响应值的25%为66.1410，r=1.0000）。

(4)进样精密度试验

将7-ACA对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录7-ACA峰面积，连续进样6次。实验结果显示，7-ACA峰面积的RSD（n=6）为0.35%，表明本分析方法进样精密度良好。

(5)重复性试验

按“1.4”项下配制对照品溶液6份，依次注入高效液相色谱仪，分析色谱图，记录7-ACA峰面积。实验结果显示，7-ACA峰面积的RSD（n=6）为0.98%，表明本分析方法重复性良好。

(6)回收率试验

取7-ACA对照品适量，精密称定，置合适的量瓶中，用适量磷酸盐缓冲液（pH7.0）使溶解，再用此缓冲液稀释至刻度，摇匀。分别制备低、中、高3个水平的对照品溶液，每个水平的溶液制备3份。每份溶液分别进样检测，记录色谱图，用峰面积并计算回收率，平均回收率为96.9%（RSD=1.4%，n=9）。实验数据见表2。

表2 回收率试验数据

(7)溶液稳定性溶液

按“1.4”项下配制供试品溶液，室温下放置，分别在0h、30min、80min、2h后分别进样，记录色谱图。实验结果显示，7-ACA保留时间RSD为0.13%，供试品中7-ACA残留含量与0h的最大差值为0.01mg/ml，供试品溶液在室温下放置2h比较稳定。根据实验结果及实验的可操作性、及时性，7-ACA残留供试品溶液配制后需及时进样进行测定。实验数据见表3。

表3 供试品溶液稳定性测定结果

(8)耐用性考察

为了考察色谱条件微小变动因素对7-ACA峰与其前后杂质峰分离度的影响，分别改变柱温（25℃、30℃和35℃）、缓冲盐溶液的pH值（6.8、7.0和7.2）以及流动相比例（105:55:840、100:60:840和95:65:840）来考察分析方法的耐用性，7-ACA峰与其前后峰的分离度均符合要求。

3.总结与讨论

建立了用高效液相色谱检测头孢菌素类抗生素产品工艺过程中7-ACA残留含量的分析方法，在生产过程中能够更好地控制反应的终止点，对工业生产具有实际指导意义；同时，可以充分利用反应物料，降低生产成本；控制反应液中7-ACA含量可降低其在最终产品中的残存量，提高产品质量。该方法具有专属性良好，分离度满足要求，操作简便，精密度、稳定性、回收率均符合方法学验证的要求，为头孢类品种检测母核7-ACA残留含量提供实验依据，能够更好地确保产品质量。