二裂酵母共生发酵溶胞物在化妆品中功效性能的研究

＊何俊杰 张目 黄晓东

（1.华南理工大学 广东 510641 2.广州悦荟化妆品有限公司 广东 510080）

皮肤共生微生物的代谢活动是通过摄取皮肤细胞分泌物进行物质与能量交换，其对维护健康皮肤有重要作用。皮肤共生菌群可以将表皮油脂分解成游离脂肪酸，调节皮肤表面酸碱度抑制致病菌的生长，释放抗菌物质抑制病原菌的增殖，调节宿主皮肤固有免疫防御系统，抵御致病生物体侵害。双歧杆菌作为肠道共生菌群中的优势益生菌，对机体皮肤健康的促进作用具有独特优势，被广泛应用在皮肤健康与护肤品领域[1-2]。双歧杆菌发酵底物经过灭活、超声等方式获得菌裂解物，即双歧杆菌发酵产物溶胞物，常称二裂酵母发酵产物溶胞产物，可用于护肤领域的产品[3]。二裂酵母在发酵过程中会产生多种氨基酸、肽类、蛋白质、多糖、核苷酸、维生素以及各类分子介质，可以滋养、修复肌肤，补充皮肤所需养分，降低紫外线对皮肤细胞DNA的损伤，同时具有的抗炎、修护、紧致、抗皱、抗衰老等作用，目前二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵产物溶胞产物已经录入《已使用化妆品原料名称目录》（2021版）作为化妆品原料使用[4-5]。本文从皮肤共生体系的微生物中选取出优异双歧杆菌进行工程发酵，获得二裂酵母共生发酵溶胞物，通过细胞活性、基因表达促进测试、自由基清除测试等体外测试方法对二裂酵母共生发酵溶胞物的抗皱、紧致、抗氧化的效果进行研究。

1.实验部分

(1)主要材料、试剂与仪器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析纯，均买于Sigma公司；胎牛血清，FSP500；RNAlater溶液，R0118；DMEM培养基，生物级，均买于赛默飞公司。TRIzol试剂，100T，阿拉丁公司；PrimerScript RT试剂盒，RR047A，Takara公司；实时PCR试剂盒，RR420A，Takara公司。人成纤维细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司提供。

多功能酶标仪，HBS-1096A，德铁；分析天平，BSA224S，德国赛多利斯；显微镜，SG-300，萨伽；紫外分光光度计，U2910，日立；PCR扩增仪，BIO-RAD，伯乐；超声清洗机，VGT-2127QT，威固特。

(2)实验方法

①I型胶原蛋白（CollagenI）含量测试

制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，培养24h。弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同质量分数的测试样品、阴性对照，培养箱孵育24h，每孔加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液，培养箱孵育4h。去除孔中液体，每孔加入150μL DMSO，置于振荡器振荡15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100%，计算各组相对细胞活性（Viability）

式中：

AS：测试样品的在450nm处吸光度；

AC：阴性对照在450nm处吸光度；

A0：空白组在450nm处吸光度。

②斑马鱼I型胶原蛋白基因（col1a1a，col1a1b,col1a2）与弹性蛋白基因（Elna）表达促进测试

参照T/HPCAI OOX—2022《化妆品抗皱、紧致功效—斑马鱼胶原蛋白、弹性蛋白基因表达测试方法》测试。

③化妆品自由基（DPPH）清除测试

二裂酵母共生发酵溶胞物稀释液：取发酵产物原液去离子水依次稀释为1%、3%、5%、10%水溶液作为样品。

维生素C（VC）溶液（作阳性对照组）：使用去离子水配置为0.001g/L、0.002g/L、0.004g/L、0.006g/L、0.008g/L、0.01g/L、0.02g/L和0.5g/L的VC溶液，备用。

将样品溶液、溶剂或DPPH溶液按等体积混合，避光常温30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm检测各组吸光度，记录数据。将溶液混匀后，避光常温30min，吸取200μL移入96孔板中，在517nm检测各组吸光度，记录数据。

清除率计算公式为：

式中：

T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；

T0—样品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；

C0—溶剂本底吸光值。

2.结果与讨论

(1)CollagenI含量测试

二裂酵母共生发酵溶胞物的测试质量分数为1%、3%、5%进行促进CollagenI含量检测，图1结果显示，1%的添加量即具有促进CollagenI含量的效果，且效果随着质量分数的升高而提升。二裂酵母共生发酵溶胞物能够显著促进CollagenI含量的效果，且呈剂量依赖性，因此，具有抗皱和紧致的功效。

图1 二裂酵母共生发酵溶胞物不同质量分数促进CollagenI含量测试结果

(2)斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进测试

前述从细胞水平说明二裂酵母共生发酵溶胞物具有抗皱和紧致的功效，现从分子水平同样对溶胞物进行测试。斑马鱼的I型胶原蛋白分布与人体相类似，通过测试斑马鱼I型胶原蛋白基因（col1a1a，col1a1b和col1a2）表达，来评价原料或产品的抗皱和紧致效果[6]。

从图2结果表明1%的添加量即对斑马鱼collalb和col1a2两种基因表达具有显著促进作用，促进率随配方质量分数提升而同步提高，当配方质量分数提升至5%后，对斑马鱼col1a1b和col1a2基因表达的促进效果提升趋于平缓，但对斑马鱼col1a1a的促进作用效果较差。可见二裂酵母共生发酵溶胞物样品能显著促进斑马鱼col1a1b和col1a2基因表达，可以促进I型胶原蛋白再生效果，具有抗皱和紧致的功效。

图2 二裂酵母共生发酵溶胞物对斑马鱼I型胶原蛋白基因相对表达量

图3 二裂酵母共生发酵溶胞物对斑马鱼弹性蛋白基因相对表达量

(3)斑马鱼弹性蛋白基因表达促进测试

弹性蛋白是人体中一种在拉伸和收缩后可以维持组织细胞原有形态，使皮肤在变形后恢复到初始形态的蛋白。该基因在斑马鱼体内的对应基因是Elna，通过测试样品能否促进斑马鱼体内Elna基因的表达，评判样品是否有促进弹性蛋白再生，使皮肤紧致的功效[7]。

二裂酵母共生发酵溶胞样品在1%配方添加量可显著促进斑马鱼Elna基因表达，但随着配方添加质量分数的提升促进效果逐渐下降。造成这种原因可能是斑马鱼完全暴露于样本溶液中，耐受性相比人体局部皮肤低，鱼胚胎会因压力问题，导致测试结果并未随配方质量分数增高而效果增强。从计量分析，1%、5%和10%配方添加量下都能显著促进斑马鱼Elna基因表达，促进弹性蛋白再生效果，二裂酵母共生发酵溶胞物具有较好的抗皱和紧致功效。

(4)化妆品自由基（DPPH）清除测试

DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此用于评判试验样品清除自由基的能力。图4结果显示，二裂酵母共生发酵溶胞物在添加量1%即具有较强DPPH清除率，在添加量为3%后，DPPH清除率基本维持在较高的范围，因此在二裂酵母共生发酵溶胞物1%～10%的检测量范围中表现出较强的抗氧化性，具有较强的抗氧化效果。

图4 二裂酵母共生发酵溶胞物的DPPH清除率柱形图

3.结论

二裂酵母共生发酵溶胞物通过细胞水平的CollagenI含量测试表明，具有抗皱和紧致的功效，其次通过斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进实验，从分子水平分析抗皱和紧致功效，实验表明二裂酵母共生发酵溶胞物对col1a1b和col1a2基因表达具有明显促进作用，但对col1a1a基因的促进效果不明显，同时可以促进斑马鱼Elna基因表达，具有可以帮助皮肤抗皱和紧致的功效，另外通过DPPH清除率实验，发现二裂酵母共生发酵溶胞物具有较好的抗氧化效果。从皮肤共生体系的微生物中选取出优异双歧杆菌进行工程发酵，获得二裂酵母共生发酵溶胞物，通过细胞活性、基因表达促进测试、自由基清除的体外测试证明二裂酵母共生发酵溶胞物具备抗皱、紧致、抗氧化的效果，具有应用在化妆品护肤领域的市场价值。