三叶青藤叶中总黄酮、荭草苷和异荭草苷提取分离方法及HPLC检测条件的研究

李卓航，冯志营，陈斌，束成杰，单承莺，聂韡，万静，蔡国强，何一波，马世宏*

（1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 210042；2.浙江省绿色清洁技术及洗涤用品重点实验室，浙江 丽水 323000）

三叶青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又名三叶崖爬藤，为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属［Tetrastigm（Miq.） Planch.］草质藤本植物，全草均可入药［1］，但对于藤叶部分的研究及利用相对较少。三叶青属于浙江省西南部道地药材，在丽水当地有“药王”的美誉。相较于一般的清热解毒类中药，长期食用三叶青是安全无毒的，并且能通过促进干扰素等免疫活性物质的合成和释放增强人体免疫力［2-4］。《浙江省中药炮制规范》与《贵州草药》记载，三叶青性寒，味苦，具有多种药理活性，尤其是抗炎作用非常广泛。目前从三叶青中提取分离鉴定出了58种化合物，其中最主要的为黄酮类成分，此外酚酸类、磷脂、糖酯类和苯磺酸类成分含量也较高［5-7］。目前对三叶青的研究多集中在抗肿瘤方面，初步确定了主要的药效成分为荭草苷和异荭草苷［8-10］。

三叶青全草均可入药，其藤叶主要成分为黄酮类化合物，具有多种药理活性。三叶青自古就被作为中药使用，近年来随着现代医学对其抗肿瘤功效的发掘，其利用价值大大提升［11-12］。目前抗肿瘤研究主要集中于三叶青地下部分，而藤叶部位的化学成分组成、药理活性临床应用研究较少，限制了三叶青藤叶部位的开发，造成了一定的资源浪费［13-15］。本研究通过对三叶青藤叶部分的总黄酮、荭草苷以及异荭草苷的提取分离及高效液相色谱测定方法的考察，确定了适用于三叶青中主要有效成分单体测定的参数指标，以期为三叶青组分的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KF-1209 电子天平（中国凯丰集团有限公司）；KQ-210A 超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）；DS-1 组织粉碎机（北京华欣科创科技有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪器（上海亚荣生工仪器厂）；SHZ-DⅢ 循环水式多用真空泵（予华仪器责任有限公司）。

1.2 试验材料

三叶青购自亳州市弘宝堂商贸有限公司；荭草苷标准品（标准品 ≥ 99.5%）、异荭草苷标准品（标准品 ≥ 99.5%）均购自阿拉丁科技有限公司；甲醇、乙醇、丙二醇、丁二醇均购自阿拉丁科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

准确称量适量三叶青藤叶进行提取，充分粉碎后过40目筛。依照料液比1 ∶ 15进行提取，提取溶液依次选择不同浓度的乙醇、丙二醇或丁二醇，设置回流装置进行有效成分提取，提取时间设定为3 h。所得的溶液依照4 000 r/min离心15 min后去上清进行抽滤，得到滤液即为三叶青黄酮提取液。

1.3.2 标准品溶液的制备

精确称量芦丁标准品7.200 mg，加入50%乙醇溶液定容至25 mL容量瓶中，混合均匀，制得质量浓度为0.288 mg/mL的芦丁标准品储备液。

精确称量荭草苷标准品1.000 mg，加入50%乙醇溶液定容至25 mL容量瓶中，混合均匀，制得浓度为0.04 mg/mL的荭草苷质量标准品储备液。

精确称量异荭草苷标准品5.000 mg，加50%乙醇定容至25 mL棕容量瓶中，混合均匀，制得质量浓度为0.2 mg/mL的异荭草苷标准品储备液。

1.3.3 三叶青藤叶部位有效成分含量测定

三叶青藤叶部分总黄酮含量测定：芦丁标准品储备液中加入0.3 mL的5% NaNO2溶液，静置6 min后加入0.3 mL的10% Al（NO3）3溶液混合均匀，静置6 min后，加入4% NaOH溶液4 mL，最后用50%乙醇溶液定容至10 mL，静置20 min后高速离心6 min，取上清液作为显色后的样品溶液。空白对照中加入0.3 mL的5% NaNO2溶液、0.3 mL的10% Al（NO3）3溶液和4 mL 的4% NaOH 溶液，最后用50%乙醇溶液定容至10 mL，于500 nm处检测吸光度。

三叶青藤叶部分荭草苷及异荭草苷含量测定：取异荭草苷标准品溶液和供试品溶液各0.5 mL，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇补足至6 mL，精密加入5%NaNO2溶液1 mL，混合均匀，静置 6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，混合均匀，静置6 min；加入4%NaOH溶液10 mL，加水稀释至刻度，混合均匀，静置15 min，于400 nm处检测吸光度。

1.3.4 色谱条件

三叶青藤叶部分总黄酮含量测定：色谱柱选择Aglient C18柱（250 mm × 4 .6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）- 0.5%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～ 10 min，20% A；10 ～ 15 min，20% → 25% A；15 ～ 20 min，25% →33.5% A；20 ～ 23 min，33.5% → 33.5% A；23 ～ 30 min，33.5% → 40% A；30 ～ 40 min，40% → 20% A）。检测波长为340 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为40℃。

2 结果与分析

2.1 三叶青总黄酮含量检测

将芦丁标准品储备液稀释成0.028 80、0.0230 4、0.017 28、0.011 52、0.005 76 μg/mL的标准品溶液，按1.3.3方法进行定量，以进样液中芦丁的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并计算出芦丁的线性关系方程为Y= 6.319 4X+ 0.000 6，R2=0.999 2。根据标准曲线计算不同提取溶剂提取得到的三叶青藤叶部分中的黄酮含量，结果见表 1。结果表明，40%乙醇作为溶剂提取得到总黄酮含量较高。

表1 不同提取溶剂提取三叶青藤叶样品中总黄酮含量Tab.1 Content of total flavonoids in the ground parts of T.hemsleyanum samples with different extract solvents

2.2 三叶青藤叶黄酮单体检测方法确定

2.2.1 三叶青藤叶黄酮色谱条件分析

按照色谱条件，对稀释为2 μg/mL的标准品溶液和供试样品溶液分别进行检测，检测结果如图1和图2所示。由检测结果可知，荭草苷和异荭草苷具有明显的特征性吸收峰，特征峰的出峰时间分别为24.834 min和25.774 min，供试样品溶液中的荭草苷和异荭草苷在此色谱条件下，实现了与其它物质的分离，特征峰明显，出峰时间分别为24.765 min和25.61 min。表明该色谱条件适于三叶青中荭草苷和异荭草苷的测定。

图1 荭草苷和异荭草苷标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of orientin and isoorientin reference substance

图2 三叶青藤叶供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of ground parts of T. hemsleyanum test article

2.2.2 线性关系考察

将荭草苷和异荭草苷混标标准品储备液稀释成4、2、1、0.5、0.4 μg/mL浓度的标准品溶液，依次检测。以不同浓度标准品溶液中荭草苷和异荭草苷的浓度为横坐标，以特征峰的峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，并计算出荭草苷的线性关系方程为Y= 1.052 4X- 0.508 6，R2= 0.999 7；异荭草苷的线性回归方程为Y= 1.665 0X- 0.826 4，R2= 0.999 6。结果表明，荭草苷和异荭草苷的浓度在4～0.4 μg/mL范围内，其峰面积与进样液中荭草苷和异荭草苷浓度具有良好的线性关系。

2.2.3 精密度考察

按照相同检测方法，再次对供试样品溶液进行检测，并根据特征峰峰面积计算得出供试样品中荭草苷的平均含量为3.58 ± 0.04 μg/mL，RSD为1.04%（n= 6），小于3.0%；异荭草苷的平均含量为1.47 ±0.02 μg/mL，计算出RSD为1.01%（n= 6），小于3.0%，表明该方法的精密度良好。

2.2.4 重复性考察

取同一三叶青样品分成6份，分别按照试验方法提取制成供试样品溶液，按色谱条件分别进样分析，计算测定结果，并对结果进行统计分析，计算出RSD为 1.44%（n= 6），小于3.0%，表明其重复性良好。

2.2.5 加样回收率测定

分别精密吸取荭草苷和异荭草苷对照品溶液2、3、4 mL，静置于20 ml容量瓶中，挥干，取6份已知含量的供试样品溶液于容量瓶中并加入甲醇溶液稀释至刻度，按照1.3.4检测条件进行HPLC检测，根据标准曲线计算荭草苷和异荭草苷的含量，并计算加样回收率，结果见表2和表3。

表2 荭草苷加样回收率试验结果Tab. 2 Test results of sample recovery of orientin

表3 异荭草苷加样回收率试验结果Tab. 3 Test results of sample recovery of isoorientin

2.3 提取方法考察

取同一批三叶青药材藤叶，按1.3.1所述方法分别用40%乙醇、70%乙醇、10%丙二醇、30%丙二醇、10%丁二醇和30%丁二醇制成供试品溶液，按照1.3.4检测条件进行测定。根据标准曲线计算藤叶荭草苷和异荭草苷的含量，结果见表4。结果表明，30%丙二醇作为溶剂所测荭草苷含量较高；40%乙醇作为溶剂所测异荭草苷含量较高。

表4 不同提取溶剂提取三叶青藤叶部分样品中黄酮单体样品含量Tab. 4 Extraction of flavonoid monomer content in the ground parts of T. hemsleyanum samples with different extract solvents

3 讨论

3.1 有效成分分离鉴定

近年来，对三叶青中有效成分及其药理活性的研究主要以黄酮或未标明成分的提取物为研究对象，发现其可有效抑制各类癌症细胞的增殖和迁移。《植物名实图考》《浙江民间常用草药》以及《全国中草药汇编》记载了三叶青具有清热解毒、消肿止痛、化痰散结、抗炎解毒等功效［17-19］，针对这些功效及其对应的有效成分研究较为单一而浅显，难以为三叶青的全面发展提供理论基础，故此本研究对三叶青中荭草苷及异荭草苷的含量进行分离鉴定，以求为三叶青多方位发展提供有力支持。

3.2 提高三叶青利用度

我国对三叶青的研究起步较晚，研究方向较为单一，因此，直至目前三叶青仍未被收录进《中华人民共和国药典》，目前，仅在《浙江省中药材炮制规范》［20］中对三叶青进行了描述，这一点极大限制了三叶青的应用与推广。未来对三叶青的研究应加强深度和广度，以求推进三叶青产业快速发展，为三叶青产品深度研发奠定基础。

4 结论

本研究通过对三叶青藤叶部分的荭草苷、异荭草苷及总黄酮的高效液相色谱测定方法精密度、稳定性、重复性的考察，确定了适于三叶青中化学成分HPLC测定的条件。考察不同提取溶剂对黄酮提取效率的影响，可知30%丙二醇作为溶剂，所测荭草苷含量较高；40%乙醇作为溶剂，所测异荭草苷含量较高。通过该方法测定三叶青藤叶荭草苷和异荭草苷含量分别为3.58 μg/mL和1.47 μg/mL。

近年来，许多研究表明三叶青具有很好的抗肿瘤功效，引起了广泛关注。三叶青的种植和加工产业也逐渐兴起，于2018年被列为“新浙八味”之一，也证实了其具有极大的开发利用潜力［16］。但是，短时间的快速发展也暴露出很多问题，目前对三叶青的理论研究还不够全面，尤其存在提取工艺落后、特征性成分不明的问题，这也极大的限制了三叶青的开发与推广，为了更好地开发利用三叶青资源，提高其综合价值，本文对三叶青中有效成分的提取及检测方法进行了探究。

综上所述，随着三叶青相关研究的加深，其药用效益与经济价值也将进一步提高，必将带动我国三叶青产业的持续、快速发展。在新兴技术高度发展发达的今天，三叶青的开发应用也将走向工业化、大众化，以充分开发利用我国丰富的三叶青资源。