防风总色原酮苷元提取工艺优化及其抗炎活性研究

陈浩，李艳露，韩佳宏，宋佳琪，韩梅，蔡恩博，杨利民

（吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118）

防风为伞形科植物防风［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根，具有解热、镇痛、抗炎等药理作用［1-2］。产地主要分布在内蒙古、吉林、黑龙江、辽宁等省。

色原酮类化合物被认为是防风中最重要的活性成分［3］。研究表明，色原酮苷元的活性显著优于其原生苷，如升麻素的药理活性强于升麻素苷［4-5］。但苷元类成分在防风中含量较低［6］，限制了该类成分与防风药材的发展。过往研究的重点在于防风总色原酮的提取，本研究在其基础上，加入并考察了酶解过程。以升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇总提取率为指标［7］，优化防风总色原酮苷元提取工艺，并初步考察其抗炎活性，为防风研究提供参考。

1 实验材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

防风采自吉林农业大学药植园，经吉林农业大学中药材学院韩梅教授鉴定为3年生伞形科植物防风［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根。

小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）购于中国科学院上海细胞库。

1.2 仪器

Agilent Model 631高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），SC-3610型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），微量移液器（赛多利斯科学仪器有限公司），BSA224S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司），THZ-92A-A气浴恒温振荡器（青岛明博环保科技有限公司），RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 试剂

纤维二糖酶（宁夏夏盛实业集团有限公司），升麻素标准品、升麻素苷标准品、5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品及5-O-甲基维斯阿米醇标准品（上海源叶生物科技有限公司）；一氧化氮试剂盒（普洛麦格试剂有限公司），色谱级甲醇（中国上海费雪科技有限公司），分析级无水乙醇（北京化工厂）；二甲基亚砜、高糖培养基（索莱宝生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 HPLC测定防风色原酮苷元含量

2.1.1 对照品溶液的制备

分别精密称取升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、5-O-甲基维斯阿米醇对照品适量，甲醇定容，配置成2 mg/mL储备液，于4℃保存，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

将干燥的防风粉碎，过60目筛。恒重后，精确称取样品粉末约0.500 g，置于150 mL三角瓶中，加入一定量的纤维二糖酶，精密量取并加入30 mL水，称重，一定温度下恒温气浴震荡反应一定时间，冷至室温，补足重量，再精确量取并加入30 mL无水乙醇，称重，静置过夜，35℃超声1 h，冷至室温，补足重量，离心后取上清液备用。

2.1.3 参比供试品溶液的制备

按照“2.1.2”项下条件，不加入纤维二糖酶，制备参比供试品溶液。

2.1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇（B）-水（A），梯度洗脱程序为0 ～ 5 min，40% ～ 45% B；5 ～ 10 min，45% ～ 60% B；10 ～ 15 min，60% ～ 80% B；15 ～ 20 min，80% ～ 95% B；20 ～30 min，95% ～ 40% B；流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10 μL［8］。

2.1.5 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，置于1 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合对照品溶液A ～ G，浓度分别为：升麻素苷（25 ～0.390 6 μg/mL）、升麻素（25 ～ 0.390 6 μg/mL）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（50 ～ 0.781 3 μg/mL）、5-O-甲基维斯阿米醇（25 ～ 0.390 6 μg/mL）。分别进样10 μL，按“2.1.4”项下中色谱条件进行HPLC分析，以进样质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，并计算线性关系方程。

2.1.6 精密度实验

精密吸取“2.1.5”项下混合对照品溶液B，按“2.1.4”项下色谱条件进样检测，连续进样6次。计算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇峰面积的RSD。

2.1.7 重复性实验

取同一批供试品粉末，平行6份。按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件依次进样检测。计算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇的提取率及RSD。

2.1.8 稳定性实验

取同一批供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件在0、4、8、12、16、20、24 h分别进样测定。计算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇峰面积的RSD。

2.1.9 加样回收率实验

取已测定的防风样品6份，每份0.250 g，精密称定，分别精密加对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件进行测定，分别计算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇的平均加样回收率及RSD。

2.2 单因素试验设计

按“2.1.2”项下条件，考察加酶量（质量分数：5%、10%、20%、50%、80%、100%）、酶解反应时间（10、20、30、60、90、120 min）、酶解反应温度（20、30、40、50、60、70℃）对防风总色原酮苷元提取率的影响。以升麻素与5-O-甲基维斯阿米醇总提取量代表防风中总色原酮苷元含量，按下列公式计算提取率：

苷元提取率 = 供试品苷元浓度 × 定容体积 ×稀释倍数/供试品取样量

2.3 响应面试验

在单因素试验的基础上，以加酶量（X1）、反应时间（X2）、反应温度（X3）为响应因子，以升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇总提取率为响应值（Y），通过Design Expert V 12.0软件安排试验。

2.4 最佳提取工艺的确定与验证

为了验证模型预测的准确性，修正最佳提取参数：加酶量90%、反应时间60 min、反应温度56℃，应用最佳提取工艺进行提取，重复实验3次，并计算得率。

2.5 防风总色原酮体外抗炎活性评价

2.5.1 细胞活力测定

按最佳提取参数，提取防风总色原酮苷元（升麻素含量：2.497 mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇含量：1.991 mg/g）。参考文献方法［9］，浓缩提取液，加水分散，通过D101型大孔树脂柱，依次用水、50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱流份，回收溶剂，冷冻干燥，即得防风色原酮苷元部位（样品1）。

不加酶提取防风总色原酮苷元（升麻素含量：1.349 mg/g、5-O-甲基维斯阿米醇含量： 0.031 mg/g）。按上述方法，即得参比防风色原酮部位（样品2）。

分别精密称取上述样品粉末适量，用DMSO溶解，加入完全培养基（DMEM高糖培养基 ∶ 胎牛血清 ∶ 青霉素-链霉素 = 10 ∶ 1 ∶ 0.1）稀释配制成0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的终浓度不超过0.1%［9］。取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种到96孔板上，每孔1.5 × 104个细胞，设置6个复孔，在二氧化碳培养箱中37℃培养24 h。弃去旧培养基，替换为含不同浓度样品的完全培养基，继续培养24 h，根据CCK-8制造商的方案，进行细胞活力测定［10-11］。

2.5.2 一氧化氮含量测定（NO）

分别精密称取样品粉末适量，用DMSO溶解，加入完全培养基稀释配制成5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的终浓度不超过0.1%。取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种到96孔板上，每孔1.5 × 104个细胞，培养24 h，镜下观察细胞状态正常；设置空白组、LPS组、给药组，每组6个复孔，在CO2培养箱中37℃培养24 h。弃去旧培养基，给药组每孔加入不同浓度受试药物，同时加入1 μg LPS。继续培养48 h后，离心取上清，分组处理，Griess法检测，根据说明书制得的标曲计算得到不同组中产生NO的量［12］。并计算二者NO抑制率IC5（0Half maximal inhibitory concentration）。

2.7 数据分析

采用SPSS 26统计学软件分析，GraphPad Prism 9.0 作图，数据资料采用均值±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 HPLC方法学考察

3.1.1 线性关系考察结果

按“2.1.4”项下中色谱条件进行HPLC分析，以进样质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，并计算线性关系方程，见表1；混合对照品溶液（A）、参比供试品溶液（B：未加酶提取样品）及供试品溶液（C：最佳工艺下提取样品）中升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇的高效液相色谱图，见图1。

图1 标准品和样品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference and sample

表1 回归方程和相关系数Tab.1 Regression equation and correlation coefficient

3.1.2 精密度实验结果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇峰面积的RSD分别为0.83%、1.56%、1.34%、1.66%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 重复性实验结果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇提取率的RSD分别为1.86%、1.91%、1.97%、1.92%，表明方法重复性良好。

3.1.4 稳定性实验结果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇峰面积的RSD分别为1.44%、1.93%、0.99%、1.48%，表明方法稳定性良好。

3.1.5 加样回收率实验结果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷及5-O-甲基维斯阿米醇的平均加样回收率分别为100.04%、100.19%、102.26%、98.70%，RSD分别为2.51%、2.50%、1.65%、2.26%。

3.2 单因素试验结果

由图2可知，加酶量从0 ～ 50%时，提取率显著增加，加酶量从50% ～ 80%时，提取率增长速率逐渐缓慢，加酶量80%时提取率最大，为4.504 mg/g，继续增加酶用量提取率逐渐降低，但变化不大。因此，最适加酶量在50% ～ 100%范围内。由图3可知，酶解反应时间从0 ～ 60 min时，提取率显著升高，在60 min时达到最大，为4.393 mg/g，60 min后提取率变化不大，时间过长不适合工业化生产。因此，最适反应时间在30 ～ 90 min。由图4可知，酶解反应温度在0 ～ 50℃时，提取率显著升高，反应温度在50℃时，提取率达到最大，为4.532 mg/g，50℃之后，提取率随温度变化不大。因此，最适酶解反应温度在40 ～ 60℃。

图2 不同加酶量对总色原酮苷元提取率的影响Fig.2 Effects of different enzyme dosage on extraction rate of total chromogen aglycones

图3 不同反应时间对总色原酮苷元提取率的影响Fig.3 Effects of different reaction times on extraction rate of total chromogen aglycones

图4 不同反应温度对总色原酮苷元提取率的影响Fig.4 Effects of different reaction temperatures on extraction rate of total chromogen aglycones

3.3 响应面试验结果

3.3.1 Central-Composite试验设计

在单因素试验的基础上，以加酶量（X1）、反应时间（X2）、反应温度（X3）为响应因子，以升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇总提取率为响应值（Y），通过Design Expert V 12.0软件进行设计，各个因素的水平据单因素的结果而定，根据星点设计的原则，每个因素设5组水平，通过不同物理参数来筛选各因素最优组合条件。试验因素与水平见表2。响应面实验结果见表3。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and levels

表3 Central Composite响应面试验设计与结果Tab.3 Central Composite response surface test design and results

3.3.2 模型建立与方差分析

将表3所得数据通过Design Expert 12.0软件进行多元拟合，以防风总色原酮苷元提取率Y为响应值、以加酶量X1、反应温度X2、反应时间X3为自变量，建立多元二次方程：

由表4展示的方差结果进行进一步分析，实验过程中的各个因素与响应目标值之间存在着复杂的交互影响关系，可以看出一次项因子X1，X2、X3影响显著，X22、X3

表4 方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

2影响显著，交互项中X2X3交互影响显著，而其它项不显著。通过P值比较发现单因素对模型的影响顺序为反应温度=反应时间＞加酶量。根据模型的确定系数R2= 0.9658可知，模型的可靠性较好。由该模型的确定系数P= 0.423可以看出，该模型的失拟检验是极其不显著的，实验结果说明了与之相对应的多项式进行拟合推测出来的理论数值之间有极强的相关性。该模型预测在参数允许的范围内是可靠和可重复的。从实验数据来看，该模型适用于防风总色原酮苷元的提取结果的分析和预测。

3.3.3 响应面分析

以加酶量、酶解反应时间和反应温度为自变量，构建响应面图，考察它们对防风总色原酮苷元提取率的综合影响，得出最佳提取条件。在二项式拟合模型的基础上，采用Design Expert V12.0软件做出相应的曲面图，结果见图5。根据已建立的数学模型和响应曲面形状，分析加酶量、反应时间、反应温度对防风中总色原酮苷元提取率的影响，从图中可以直观的看出各因素对响应值的影响，反应温度（X3） = 反应时间（X2） ＞ 加酶量（X1）。通过对拟合的线性方程进行更深层次的分析，最终通过软件分析给出最佳提取参数，即加酶量89.87%，反应时间59.97 min，反应温度55.95℃，在最佳提取条件下，理论应得到升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇的总提取率为4.58 mg/g。

图5 各因素交互作用对防风总色原酮苷元提取率的效应面图Fig.5 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on total chromone aglycone from Saposhnikoviae Radix

3.3.4 试验验证

为了验证模型预测的准确性，修正最佳提取参数：加酶量90%、反应时间60 min、反应温度56℃，应用最佳提取条件进行重复实验3次，得到升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇的平均总提取率为4.49 mg/g（RSD = 0.9%，n = 3），与理论值相差2%，未加酶的平均提取率为1.38 mg/g，提高了3倍以上。实验的结果与软件提供的预测值基本上是相同的，说明实验所用的模型对防风总色原酮苷元的提取是适用的，高效的。

3.4 体外抗炎活性评价

3.4.1 细胞活力

如图6所示，RAW 264.7细胞给药处理24 h后，存活率均未受到抑制，说明防风总色原酮苷及苷元（0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L）对RAW 264.7细胞都不具有毒性。

图6 样品1（a）， 2（b）对细胞存活率的影响Fig.6 Effects of sample 1 （a）， 2 （b） on cell viability

3.4.2 一氧化氮含量（NO）检测

由图7可知，与空白组比较，LPS组NO水平显著增加（P＜ 0.001），提示造模成功；各给药组与LPS组比较，NO含量水平均差异显著（P＜ 0.001）；给药组间，样品1抑制NO分泌效果优于样品2， 25 mg/L剂量下样品1即与100 mg/L样品2效果相当。表明防风总色原酮苷元对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO具有很好的抑制作用，并显著优于参比提取物。NO抑制率IC50分别为2.30 ± 0.34，3.32 ±0.47 mg/L。

图7 样品1（a）， 2（b）对RAW 264.7细胞上清中NO含量的影响Fig.7 Effects of sample 1（a）， 2（b） on NO content in supernatant of RAW 264.7 cells

5 讨论与结论

本研究在酶解基础上，采用超声辅助乙醇法提取防风干燥根中的色原酮苷元，提取率有较大提高，苷元转化彻底。在单因素实验基础上，运用响应面法对苷元提取条件进行优化，确定防风总色原酮苷元的最佳提取工艺参数为：加酶量89.87%，酶解时间59.97 min，酶解温度55.95℃。方差结果显示，影响提取率的单因素依次为：反应温度 = 反应时间 ＞ 加酶量。与传统提取方法相比，该工艺操作容易，提取效率高，稳定性好。纤维二糖酶安全环保，成本低廉。对总色原酮苷元提取物进行体外抗炎活性研究，发现在小鼠巨噬细胞炎症模型中，工艺优化前后提取物的浓度大于25 mg/L时，均对上清液中一氧化氮（NO）分泌具有显著抑制作用，而最佳提取条件下总色原酮苷元提取物25 mg/L时与优化前提取物100 mg/L时作用相近，NO含量接近正常水平，具有良好的抗炎活性。为防风创新药物的研发提供参考，为防风药材的综合开发利用提供了新的思路。