不同品种油茶壳皂素比较研究

王杨慧，丁丹宁，张锋伦，陈殿松，朱莉伟，蒋建新*

（1.北京林业大学 材料科学与技术学院/国家林业和草原局木本香料（华东）工程研究中心，北京 100083；2.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；3.广州德谷个人护理用品有限公司，广东 广州 510880）

油茶（Camellia oleiferaAbel）是我国特有的木本油料树种，主要分布于我国长江流域及其以南地区，是我国栽培面积最大、分布最广的食用油料树种之一。油茶壳是茶油加工过程中产生的副产物，作为农业废弃物，每年有超过300万吨被丢弃或焚烧［1-3］，不仅浪费资源，还导致了环境污染问题。因此，要提升我国油茶综合效益，就要对油茶壳进行资源化利用［4-7］。

目前，我国油茶产业存在产量低且品质差异性大等诸多问题，因此选育高产优质的良种成为科研人员关注的重点，除油茶果实和油茶品质外，油茶壳的利用也应成为选育优质油茶的重要指标之一［8］。油茶壳中富含茶皂素，茶皂素是一种五环三萜类的齐墩果烷型皂苷混合物，因其具有优良的发泡、稳泡、乳化、去污、分散等功能及杀虫、抗菌、抗高血压、抗氧化等生物活性，被广泛用于天然抑菌洗手液［9］和香皂、保鲜包装［10］、绿色农药［11］及新型纺织助剂和解酒饮料［12］等产品的开发，应用涉及日化、农业、医药、建材和水产养殖等多个行业。从文献报道的情况来看，由于皂素糖体和单体的多种组合，同一植株的不同部位、同一种植物在不同的生长环境中茶皂素都会存在结构与性能上的差异。Morikawa等［13］研究表明，茶花皂苷在不同品种和地区间存在差异；Fan等［14］发现茶叶皂苷含量受到茶树基因型和生长条件的影响；陈宏宇等［15］研究发现同一地区多个品种茶叶的籽皂素总量、单体种类及含量根据它们外形的不同也具有显著差异。目前我国油茶种类繁多，但关于不同品种茶树的油茶壳中茶皂素的含量及性质差异性相关的对比研究报道较少。本论文以我国广泛种植的湘林210、华鑫、小果三种油茶品种为研究对象，探究其油茶壳皂素结构与性能的差异，并对油茶皂素表面活性、发泡及乳化性能进行了系统评价，旨在为油茶壳皂素高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

小果、湘林、华鑫三种品种油茶壳于2022年12月采集自湖南大三湘，干燥粉碎，过40目筛，于自封袋中备用。

无水乙醇、盐酸、浓硫酸、碳酸钠、氢氧化钠、硫酸钾、硫酸铜、石油醚（60 ～ 90℃），均为分析纯试剂，购自北京现代东方化学品有限公司；纤维二糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖为标准品，购自Sigma-Aldrich公司。

R203型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；ALPHA-T型红外光谱仪（德国Bruker公司）；Agilent 1260型高效液相色谱（美国Agilent公司）；SCIWNTZ-18N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BZY-101型自动表面张力仪（上海方瑞有限公司）；SXT-06型六联索氏提取器（上海本昂科学仪器有限公司）。

1.2 皂素提取

采用无水乙醇为溶剂，在料液比1 ∶ 10（g/mL）、温度60℃下浸提脱脂后的油茶壳原料三次，抽滤得到提取液，旋蒸浓缩干燥后得粗皂素。粗皂素得率（y）根据下式计算：

式中：m1为粗皂素质量，g；m2为原料质量，g；w为原料水分，%；

1.3 皂素纯化

1.3.1 树脂预处理

根据参考文献［16］的方法，并稍有更改。选用弱极性、比表面积为480 ～ 520 m2/g的AB-8大孔树脂纯化皂素，采用湿法装柱，浸泡24 h后，继续用乙醇洗至流出液加水不呈白色浑浊为止，再用去离子水洗至无醇味。用5% HCl溶液浸泡3 h，去离子水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡3 h，去离子水洗至中性，备用。

1.3.2 柱层析

粗皂素样品纯化过程如简明流程图（图1）所示。

图1 粗皂素梯度洗脱纯化简明流程图Fig.1 Simple flowchart for gradient elution purification of crude saponin

1.4 组成测定

1.4.1 脂肪

参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》［17］中的索式抽提法，使用沸程为60 ～ 90℃的石油醚测定三种品种油茶壳脂肪含量。

1.4.2 游离糖

采用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography， HPLC）测定粗皂素水溶液中游离糖的含量C游离糖，将粗皂素配置成2 mg/mL溶液于液相色谱中分析。分析条件为：HPX-87P柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm），流动相为水，流速为0.6 mL/min，柱温为75℃，进样量为5 μL，检测器为蒸发光散射检测器。

1.4.3 皂素含量

采用HPLC法［18］对稀酸水解后皂素样品中的单糖含量C单糖进行测定，并对固体残渣进行干燥得皂苷元含量C皂苷元。

分析条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.03%硫酸溶液；流速：0.6 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：75℃。

1.5 茶皂素性能表征

1.5.1 表面张力

根据文献［19］的方法，略有调整。将皂素样品用去离子水配制为12 g/L溶液并梯度稀释至6、3、1.5、0.75、0.375 g/L，30℃水浴30 min。采用吊片法，使用表面张力仪测定各浓度溶液表面张力，重复3次取平均值，以溶液浓度的对数lgC为横坐标，表面张力为纵坐标绘制曲线，从曲线上的拐点读取临界胶束浓度（Critical micelle concentration，CMC）。

1.5.2 起泡性及稳泡性

采用量筒震荡法［20］对纯化前后皂素的泡沫高度进行测量，取10 mL浓度分别为0.3% 、0.6%、1.2%的皂素水溶液加入50 mL具塞量筒，剧烈震荡3 min，记录开始时的泡沫高度和30 min后的泡沫高度，并分析起泡高度与皂素浓度相关性作为皂素稳泡性的量度。重复测定3次，取平均值。

1.5.3 乳化性及乳液稳定性

石蜡是一种性质极不活泼的碳氢化合物，结构上完全没有亲水基团，能避免一些干扰［21］。因此实验以石蜡为油相，采用均质机制备乳液，以10 000 rpm/min的速度均质2 min，在CMC下的皂素与石蜡比例1 ∶ 1（W/O），取10 mL乳液，在室温下放置0 h、12 h、24 h，观察乳液层的变化。

1.5.4 红外光谱分析

将3种品种油茶壳皂素粗提物和75%乙醇纯化皂素在105℃烘干后，与溴化钾（KBr）按照质量比1∶ 100 混合均匀，研磨后进行压片。采用 Bruker-ALPHA傅里叶变换红外光谱仪在波数为400 ～ 4 000 cm-1范围内进行扫描。

1.6 数据分析

实验数据采用Excel 2019进行数据处理和统计分析，IBM SPSS 27.0软件进行单因素方差分析，LSD法多重比较，结果以“平均值 ± 标准差”表示，P＜ 0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 油茶壳成分分析

通过测定油茶壳原料中水分、灰分、脂肪含量以及粗皂素得率，比较三种品种油茶壳间成分差异。如表1所示，三种品种油茶壳中灰分含量最高为华鑫油茶壳4.19%，脂肪含量均小于1%，其中湘林油茶壳脂肪含量最低，为0.37%，与张文婷等［22］的研究结果相符合。三种品种粗皂素得率均为20%左右，其中湘林的得率最高，小果的最低，与吕复云等［23］采用60%乙醇浸提方法提取茶皂率得率（22.36 ± 0.15）%相当，高于杜志欣等［24］人以80%乙醇超声辅助提取得率。由表1中方差分析结果可知，湘林品种粗皂素得率显著高于华鑫和小果（P＜0.05），且华鑫品种粗皂素得率也显著高于小果（P＜ 0.05）。

表1 油茶壳基本成分分析Tab.1 Analysis of basic components of C.oleifera shell

2.2 粗皂素化学成分分析

皂素是一种五环三萜类皂苷，由糖基、皂苷元及有机酸组成，糖体和苷元通过醚键连接。表2为皂素中单糖和皂苷元含量分析，粗提物中的总糖主要有葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，其中葡萄糖含量最高。且可以看出，三种样品中湘林品种皂苷元含量最高，达到22.17%。三种品种油茶壳乙醇粗提物中皂苷含量相差较大，湘林品种含量最高达48.53%，而华鑫油茶壳粗提物中皂素含量仅为39.73%，由表2中单因素方差分析结果可知，湘林品种油茶壳皂素含量与华鑫、小果有显著性差异（P＜ 0.05）。

表2 不同品种油茶壳乙醇提取粗皂素化学组成Tab.2 Chemical composition of crude saponins extracted by ethanol from different varieties of C. oleifera shells

2.3 结构及性能表征

2.3.1 红外光谱

不同品种茶皂素的红外光谱如图2所示，三种茶皂素的特征吸收峰基本一致，说明提取物基本结构相同。山茶属植物皂苷为酯皂苷，具有两个特征吸收带1 720 cm-1和3 400 cm-1［25］。谱图中湘林、华鑫和小果均在3 400 cm-1左右有一宽峰，即为皂苷元和糖链上羟基（-OH）伸缩振动吸收峰，其中湘林在此处的吸收较强；2 927 cm-1是饱和的C-H伸缩振动吸收峰；-C=O伸缩振动吸收峰出现在1 850 ～ 1 600 cm-1范围内，1 609 cm-1吸收峰表明存在不饱和羰基；1 071 cm-1处为C-O-C振动吸收［26］。另外可根据1 350 cm-1左右的碳氢吸收，判定分子骨架为齐墩果烷型五环三萜类皂苷。

图2 三种品种油茶壳纯化皂素红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of purified saponins from three varieties of C. oleifera shells

2.3.2 表面张力

粗皂素的表面张力随样品浓度变化如图3所示，三个品种油茶壳粗皂素的CMC在0.4 ～ 0.6 g/L之间，达到CMC值时三种品种油茶壳皂素的表面张力大小为湘林 ＜ 华鑫 ＜ 小果，在42.6 mN/m左右，与文献［27］报道结果相符。其中湘林粗皂素的表面张力随着浓度的上升，由53.6 mN/m下降至42.6 mN/m，其CMC值为4.02 g/L。表面张力CMC值越小，说明皂素在溶液中形成胶束所需的浓度越低，表面活性越好［28］。通过比较发现，湘林、华鑫与小果三种品种中，湘林茶皂素CMC值最低，说明其表面活性最好。

图3 不同品种粗皂素浓度对表面张力的影响Fig.3 Effect of crude saponin concentration on the surface tension in different varieties of C.oleifera

2.3.3 起泡性和稳泡性

三个品种粗皂素泡沫高度如图4所示。三个品种油茶壳粗提物溶液均具有较强的起泡能力，且均与样品浓度有关，泡沫高度随样品浓度的增大而增高。说明皂素含量越高，起泡性能越显著。由于油茶树生长条件与品种的不同，不同样品的起泡能力有明显差异，湘林品种茶皂素的起泡能力最优，小果最差，在浓度为12 g/L时的泡沫高度分别为10.40 cm和4.08 cm。用30 s时的泡沫体积作为皂素起泡能力的指标，V5min/V30s的泡沫体积作为皂素的稳泡指标，稳泡性体现的是泡沫的存活能力［29］。

图4 不同品种皂素泡沫高度与浓度关系Fig.4 Relationship between foam height and concentration of saponins in different varieties

由表3数据可知，所有样品均具有很好的泡沫稳定性，其中华鑫品种泡沫稳定性最好，可稳定30 min不消泡。泡沫的产生量、大小及稳定性是消费者评价日化产品的重要参考，因此华鑫品种十分适合应用于清洁产品。

表3 不同品种油茶壳粗皂素溶液泡沫稳定性比较Tab.3 Comparison of foam stability of crude saponin solution from different varieties of C.oleifera shells

2.3.4 乳化稳定性

乳化性是评价皂素表面活性的一项重要指标。水相与脂相本是不相容的，乳化剂通过吸附在油相/水相界面，降低界面张力和保护液滴不聚集来促进乳化和增强物理稳定性。皂素乳化作用的实质便在于降低液-液体系中的界面张力，皂素作为乳化剂，起到使油、水两种互不相溶的液体一方以极微小的液滴均匀地分散于另一方溶液中形成较稳定的乳液状态的作用。

根据乳液静置24 h后下层分离出水层的高度作为乳化性的判定依据。下层水层高度越低，表示形成的乳液稳定性越好，皂素乳化性越好。24 h后的水层分离情况如图5所示，对比三个样品可发现华鑫皂素乳液水层高度最低为2.3 cm，乳化稳定性最佳。

图5 三个品种粗皂素乳化分层图Fig.5 Emulsification and stratification of three varieties of crude saponin

3 结论

由于油茶的种植环境、土壤类型、光照时间、降雨量、采摘时间等因素的不同，不同品种油茶壳中皂素的含量及性质均有一定的差异，本文采用无水乙醇浸提法测定油茶壳中粗皂素，通过进一步酸水解及高效液相色谱法进行皂苷含量分析，通过比较粗提物得率与其皂苷含量可知湘林粗皂素得率为23.58%，其中皂苷含量48.53%，在差异显著的三个品种油茶壳中含量最高，这有利于油茶壳高值化利用选种，为产业化发展增效。

通过综合评价粗提物表面张力、起泡性、稳泡性、乳化性与皂苷含量可知，湘林油茶壳皂素具有较高的皂苷含量和较低的CMC值，华鑫油茶壳皂素具有相对较好的起泡性及最好的稳泡性，湘林油茶壳皂素适宜用作表面活性剂，华鑫油茶壳皂素适宜用作乳化剂进行综合利用。

本文仅从品种角度对壳中皂素进行了部分性能比较，后续的研究中，在增大样品量的同时可以对不同的影响因素展开系统的研究，为全面评价油茶果提供更加详实的实验依据。