基于网络药理学与分子对接技术探讨栀子抗肝纤维化的作用机制

肖琪，马媛，陈孝强*，童黄锦**

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028；2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

肝纤维化是由各种因素引起的可持续慢性肝损伤（如病毒性、自身免疫性、药物诱导性、胆汁淤积性和代谢性疾病）［1］。其特征是细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）蛋白的过度积累，导致纤维瘢痕组织的形成和肝脏结构的扭曲［2］。肝星状细胞（Hepatic stellate cells， HSCs）的激活能调节ECM的产生和分泌，被认为是影响肝纤维化进程的关键因素［3］。随着肝纤维化的进展，可能最终发展为肝硬化，其特征是肝实质被瘢痕组织取代，并增加了患肝癌的风险。肝纤维化和肝硬化预后不佳，死亡率高，全球每年有超过一百万人死于这些疾病。幸运的是，适当的干预已显示出逆转肝纤维化的潜力［4］。然而，目前临床上缺乏经证实有效的治疗肝纤维化的药物。因此，迫切需要探索更有效的靶点和药物，以控制肝纤维化的进展并减轻其危害。

药材栀子（Gardeniae Fructus）为茜草科（Rubiaceae）栀子属（GardeniaJ. Ellis）植物栀子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果实，于十月中下旬采收，晒干或烘干。栀子始载于《神农本草经》，主产于江西、浙江、湖南等地，是卫生部发布的首批食药同源中药之一，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒等功效。在栀子中已分离的化合物主要有环烯醚萜及其苷类、有机酸及其衍生物类、黄酮类、单萜类等。现代药理学研究证实，栀子具有显著的抗炎［5］、抗氧化［6］、保肝［7］、降脂［8］等作用，常与茵陈、金银花等配伍治疗肝纤维化以及肝内胆汁淤积等症。

目前栀子对肝纤维化治疗的作用机制尚未见深入研究，本研究通过超高压液相色谱-飞行时间质谱仪（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）对栀子药材的化学成分进行辨识，利用网络药理学和分子对接技术预测栀子抗肝纤维化的效应物质及作用机制，为其临床应用及开发提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-30A型超高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Triple TOF 5600串联飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源ESI（美国AB SCIEX公司）；Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore公司）；ME204E型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BY-R20型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；MS-100恒温混匀仪（MS-100恒温混匀仪）；KQ-500E型医用超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

标准品槲皮素（批号：100081-200907）、东莨菪内酯（批号：110768-200504）购自中国食品药品检定研究院；绿原酸（批号：Y24J7K16726）购自上海源叶生物科技有限公司；京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷（批号：J-075-160906）、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（批号：S-060-160815）、棕榈酸（批号：Z-032-170426）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；咖啡酸（批号：MUST-12042403）、京尼平（批号：MUST-11122811）、栀子苷（批号：MUST-17020401）、芦丁（批号：MUST-11040302）、齐墩果酸（批号：MUST-11090502）购自成都曼斯特生物科技有限公司；京尼平苷酸（批号：CHB151101）、新绿原酸（批号：CHB160419）、西红花苷（MUST-22092106）、亚油酸（批号：CHB160902）、硬脂酸（批号：CHB170216）购自成都克洛玛生物科技有限公司。以上标准品纯度均大于98%。

甲醇、乙腈（质谱级，湖北弗顿科学技术有限公司）；甲酸（色谱级，美国 ROE Scientific INC.）；实验用水为超纯水。

2 方法

2.1 栀子药材的收集

栀子药材（10批）来源于主产区江西、浙江等地，经江苏省中西医结合医院陈孝强副主任中药师鉴定为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果实。所有样品经检验符合《中国药典》2020版一部栀子项下规定。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

栀子药材粉碎，过三号筛。精密称取粉末0.1 g，精密加入10 mL甲醇，超声提取30 min。提取液高速离心10 min（转速12 000 r/min），取上清液，进样分析前过0.22 μm微孔滤膜。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取16种标准品（槲皮素、东莨菪内酯、绿原酸、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、棕榈酸、咖啡酸、京尼平、栀子苷、芦丁、齐墩果酸、京尼平苷酸、新绿原酸、西红花苷、亚油酸、硬脂酸）适量，用甲醇溶解，配制成含各标准品约2 μg/mL混合对照品溶液。

2.3 UPLC-Q/TOF-MS分析

2.3.1 色谱条件

仪器检测条件参考已报道的文献［9］。采用Agilent Extend C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm）。流动相A和B分别为0.05%甲酸水溶液和乙腈，流速0.3 mL/min，梯度洗脱设置为：0 ～ 10 min，5% ～20% B；10 ～ 20 min，20% ～ 50% B；20 ～ 25 min，50%～ 80% B；25 ～ 30 min，80% ～ 100% B；30 ～ 32 min，100% B。柱温为35℃，进样量为2 μL。

2.3.2 质谱条件

离子源为ESI，采集模式为正负离子模式。仪器参数设置如下：离子化电压+5 500 V / -4 500 V，离子化温度550℃，去簇电压 ± 60 V，补偿电压 ± 10 V。一级和二级的扫描范围分别为m/z100 ～ 1 500和50 ～ 1 000。质谱仪每3 h进行一次自动校准。

2.4 栀子中化学成分的鉴定与活性成分的筛选

利用MS-DIAL软件对质谱原始数据进行分析，同时根据标准品提供的保留时间、二级碎片信息，将匹配度大于80%且保留时间一致的结果作为栀子药材中鉴定得到的化合物。

根据TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）提供的药物ADME参数对上述化合物作进一步筛选，这些参数包括口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）、药物相似性（Drug-likeness， DL）和人高加索结肠腺癌渗透性（Human caucasian colon adenocarcinoma， Caco-2）。OB、DL和Caco-2的阈值分别设置为20%、0.1和-5.15［10］。此外，根据文献报道将栀子中具有抗肝纤维化活性的化合物纳入范围。

2.5 栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的筛选

通过化合物数据库Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取栀子中活性成分的结构与SMILES式，并将其导入药物靶点数据库Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和Drugbank（https：//www.drugbank.com/），搜索成分靶点，设置物种为“Homo sapiens”，置信度 ＞ 0，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）将靶点名称校准为官方名称，这些靶点经合并去重后作为栀子活性成分的靶点。

同时，通过人类基因数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）和孟德尔遗传数据库OMIM（https：//omim.org/）进行检索，设置检索词“hepatic fibrosis”，设置物种为“Homo sapiens”，获得与肝纤维化相关的疾病靶点。利用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对栀子中活性成分的靶点与肝纤维化的靶点取交集，得到栀子抗肝纤维化的潜在作用靶点。

2.6 栀子抗肝纤维化的“活性成分-潜在靶点”网络构建与分析

为构建“活性成分-潜在靶点”网络图，将栀子抗肝纤维化的活性成分及其与潜在靶点的对应关系导入生物信息学分析软件Cytoscape 3.8.2（https：//cytoscape.org/）。在这个网络中，化合物和靶点分别由节点代表，并用边表示它们之间的相互作用。采用Cyto NCA对网络进行拓扑学分析，通过参考拓扑学参数对比化合物在网络中的重要性计算节点的度值。

2.7 栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的蛋白相互作用网络构建与分析

将栀子抗肝纤维化的潜在靶点上传至STRING 12.0数据库（https：//www.string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，置信度阈值为 ≥ 0.9。利用生成的PPI图，以度值为依据筛选出核心靶点。

2.8 栀子抗肝纤维化的GO功能富集和KEGG通路富集分析

将栀子抗肝纤维化的潜在靶点导入生物学信息注释数据库David（https：//david-d.ncifcrf.gov/）分别进行基因功能（Gene ontology， GO）富集分析和京都基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信号通路富集。物种选择“Home sapiens”，设定阈值p＜ 0.05，按基因命中个数简单排序。筛选出前10条与肝纤维相关的生物学条目和前20条信号通路，并通过OmicStudio云平台（https：//www.omicstudio.cn/tool）进行可视化处理。

2.9 分子对接的验证

利用ChemDraw 19.0（美国PerkinElmer公司）将栀子抗肝纤维化的核心成分转化为3D结构，并从RCSB PDB蛋白数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点的相应3D结构。通过PyMOL 2.3.4软件（美国Schrödinger公司）对核心靶蛋白进行初步处理，包括去除溶剂分子等。随后，使用AutoDock 4.2分子对接软件（http：//autodock.scripps.edu/）对核心靶蛋白和活性化合物进行加氢处理和加电荷处理，并将它们保存为“pdbqt”格式的文件。最后，使用Vina插件完成核心成分和靶点的对接。

3 结果

3.1 栀子中活性成分的筛选

通过谱库检索、标准品和文献信息［9］比对，共鉴定出栀子药材中72个化合物。根据OB ≥ 20%、DL ≥ 0.1和Caco-2 ≥ -5.15的条件筛选出18个活性成分。此外，通过文献调研发现栀子苷、芦丁、西红花苷等9个化合物虽未满足筛选条件，但具有抗肝纤维化的活性，如栀子苷能通过减轻氧化应激和炎症反应，抑制细胞凋亡，调节整体代谢，从而减轻肝纤维化［11］。芦丁能通过抑制肝星状细胞激活、促进其凋亡从而治疗肝纤维化［12］。西红花苷通过lnc-LFAR1/MTF-1/GDNF途径抑制小鼠肝星状细胞的激活［13］。最终得到27个活性成分，详细信息见表1。

表1 栀子中活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active components in Gardeniae Fructus

3.2 栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的获取

通过Swiss Target Prediction和DrugBank共筛选出445个活性成分靶点。经GeneCards和OMIM收集到6 454个肝纤维化相关靶点。取交集后获得栀子抗肝纤维化的潜在靶点331个。

3.3 栀子抗肝纤维化的“活性成分-潜在靶点”网络构建与分析

构建的“活性成分-潜在靶点”网络见图1。该网络由355个节点（24个成分和331个靶点）、946条边组成，度值大于两倍中位数的成分有8个，这些成分为栀子抗肝纤维化的核心成分。其中槲皮素、亚油酸、γ-亚麻酸、艾黄素、9-反式棕榈烯酸度值排名前5，分别为99、85、82、80、80。

图1 栀子抗肝纤维化的“活性成分-潜在靶点”网络Fig. 1 “Active ingredients potential targets” network of Gardeniae Fructus against hepatic fibrosis

3.4 栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的蛋白相互作用网络构建与分析

经STRING获取栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的相互作用关系，见图2。该网络包含331个节点，971条边，节点平均度值为5.87，度值大于两倍中位数的靶点有77个，这些靶点为栀子抗肝纤维化的核心靶点。其中酪氨酸蛋白激酶SRC（Tyrosine-protein kinase SRC， SRC）、丝裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3， MAPK3）、丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、信号转导与活化转录因子3（Signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、热休克蛋白90α家族A类成员1（Heat shock protein 90 alpha family class A member 1， HSP90AA1）度值排名前5，分别为55、50、48、44、44。

图2 栀子抗肝纤维化潜在靶点的PPI网络Fig. 2 PPI network of potential targets of Gardeniae Fructus against hepatic fibrosis

3.5 栀子抗肝纤维化的GO功能富集和KEGG通路富集分析

GO富集得到生物过程（Biological process， BP）相关条目699条，主要涉及信号转导、蛋白质磷酸化、细胞增殖的正调控等。细胞组分（Molecular function， MF）相关条目173条，主要涉及蛋白质结合、ATP结合、锌离子结合等。分子功能（Cellular component， CC）相关条目95条，主要涉及质膜、胞浆、细胞质等。各个项目排名前10的条目见图3。

图3 GO功能富集分析（前10）Fig. 3 GO functional enrichment analysis （top 10）

KEGG富集结果显示，栀子抗肝纤维化主要与以下通路相关：代谢通路、癌症通路、神经活性配体受体相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、脂质与动脉粥样硬化等。排名前20的信号通路见图4。

图4 KEGG通路富集分析（前20）Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis （top 20）

3.6 分子对接的验证

栀子抗肝纤维化排名前5的核心成分与靶点对接结果见图5A，结合能均小于0，说明这些成分与靶点能自发结合。槲皮素、艾黄素与大多数靶点结合能较低，结合活性较强，该结果与网络药理学筛选的结果一致，进一步验证了网络药理学预测靶点的可靠性。分子对接情况见图5B。

图5 化合物与靶点分子对接结果Fig. 5 Docking results of compound and target

4 讨论

现代药理学研究表明，栀子具有抗炎、抗氧化、保肝、利胆等药理作用。栀子抗肝纤维化的功效物质及作用机制尚未见深入研究。本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术检测识别出栀子中化合物74个，基于网络药理学的方法筛选出栀子抗肝纤维化的活性成分27个，潜在作用靶点331个，其中核心成分8个，核心靶点77个，涉及生物功能967条和信号通路164条，表明栀子抗肝纤维化具有多成分、多靶点的的特点。

栀子抗肝纤维化的“活性成分-潜在靶点”网络分析结果显示，在27个活性成分中，槲皮素、亚油酸、γ-亚麻酸、艾黄素、9-反式棕榈烯酸、甘草次酸、邻苯二甲酸二丁酯、齐墩果酸的度值大于两倍中位数，对整个网络具有重要的贡献意义［14］，推测这8个成分是栀子抗肝纤维化的主要功效物质。实验研究显示，槲皮素具有较强的抗炎和抗氧化能力［15］，对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠有抑制和肝保护作用。它能通过上调白细胞介素-10（Interleukin-10， IL-10）和血红素氧化酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）的表达从而抑制NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3， NLRP3）炎症小体激活和炎症因子分泌，进而发挥对急性酒精性肝损伤的保护作用［16］。亚油酸具有很强的抗炎活性［17］，且能通过肠道菌群抑制肝星状细胞中的TGF-β信号传导改善肝纤维化［18］。γ-亚麻酸虽不能直接干预肝纤维化，但其可通过减少脂肪沉积而改善非酒精性脂肪肝，这一作用可能是通过调控LKB1-AMPK-mTOR通路发挥的［19］。艾黄素是一种天然黄酮，具有具有抗氧化、抗炎活性，动物实验表明其对四氯化碳诱导的肝纤维化有保护作用［20］。甘草次酸可通过靶向活化HSC中的PRDX1/2从而引起ROS介导的细胞凋亡以改善肝纤维化［21］。另外，肝细胞铁死亡会诱发肝纤维化，有报道发现齐墩果酸能通过调节ROS/铁过载抑制氯化汞诱导的肝铁死亡［22］。关于栀子中其他成分抗肝纤维化的研究报道较少，限制了对其功效物质的进一步验证。

通过分析栀子抗肝纤维化潜在作用靶点的蛋白相互作用发现，度值排名前5位的靶点有SRC、MAPK3、MAPK1、STAT3、HSP90AA1。研究结果显示，在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化模型和肝硬化患者中，SRC表达上调。抑制SRC可以降低原代肝星状上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达，并且还能抑制转化生长因子β（Transforming growth factor β， TGF β）诱导的肝细胞结缔组织生长因子的表达。这些发现表明，SRC在肝脏纤维化中起着重要的作用，抑制SRC过度表达可在一定程度上阻止肝纤维化进程［23］。MAPK1和MAPK3是MAPK信号通路的成员。在肝组织受损时，MAPK信号通路会被激活。外来调节激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）通路在干预肝纤维化中可能发挥作用，其中p-Erk1/2的下调可能与抑制HSC增殖以及相关基因表达有关［24］。与此同时，激活JNK和p38信号通路会促进HSC的增殖［25］。综上所述，MAPK在肝纤维化进程中发挥重要作用。STAT3通过参与肝星状细胞的增殖和活化，进而参与肝纤维化的发展。在肝细胞中，适度表达的STAT3有助于促进肝细胞再生和肝脏修复。然而，过度表达的STAT3会导致肝星状细胞的活化和过度增殖，从而引发肝纤维化乃至肝脏癌变的可能［26］。作为HSP90的一个亚型，HSP90AA1的主要功能是促进目标蛋白的成熟和结构维护。它参与ATP酶活性有关的功能循环，以维持蛋白的正常功能发挥。此外，HSP90AA1还能通过调节细胞周期促进细胞增殖，并促进细胞迁移［27］。由此可见，上述关键靶点均与肝纤维化相关。

GO功能富集结果表明，栀子主要调节与肝纤维化发病机制密切相关的信号转导、蛋白质磷酸化、细胞增殖正调控、细胞凋亡过程负调控、G蛋白偶联受体信号通路、炎症反应等过程。KEGG富集结果表明，栀子通过多种途径在肝纤维化的治疗中发挥作用。值得关注的是，单个成分可能调控多个途径发挥作用，如核心成分中的槲皮素可能作用于代谢通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路等。而同一途径可能受到多个成分调控，如PI3K-Akt信号通路受到8个核心成分共同调控。已有报道证明，PI3K-Akt信号通路［28］、脂质和动脉粥样硬化［29］、Rap1信号通路［30］、MAPK信号通路［31］、钙信号通路［32］、Ras信号通路［33］与肝纤维化治疗密切相关，进一步验证了网络预测的准确性。

分子对接结果显示，排名前5的核心成分与靶点对接情况较好，能自由结合。从成分角度分析，槲皮素、艾黄素与大部分结合能较低；从靶点角度分析，MAPK3、MAPK1与大多数成分对接有较低的结合能。该结果提示栀子可能通过槲皮素、艾黄素等化合物作用于MAPK3等靶点发挥抗肝纤维化的功效。

5 结论

本研究利用UPLC-Q/TOF-MS、网络药理学和分子对接技术，初步阐明了栀子多成分、多靶点、多通路协同抗肝纤维化的作用机制。栀子可能通过槲皮素、亚油酸等活性成分作用于靶点，如MAPK3和MAPK1参与调控PI3K-Akt信号通路、脂质和动脉粥样硬化以及MAPK信号通路等通路。这种调控产生了抗炎效应、抑制肝星状细胞活化并促进其凋亡等，从而发挥抗肝纤维化的作用。这项研究为开发栀子治疗肝纤维化的新药提供了参考依据。此外，因为该研究依靠数据库分析较多，存在一定的局限性，在后续的研究中将结合体内外实验进行进一步的验证。