一种适宜高通量基因型鉴定的植物组织取样法及其应用

仲威宇,朱晓斌,夏正俊,李艳华,张丽辉

(1.长春师范大学生命科学学院,吉林 长春 130032;2.东北地理与农业生态研究所 中国科学院种子创新研究院,黑龙江 哈尔滨 150081)

我国植物资源丰富,为基因功能研究与品种选育提供了重要的遗传材料。在植物分子生物学研究中,从分子标记如SSR等筛选、已知基因的基因型鉴定、变异位点检测、重组体筛选等,都需要提取大量样品的DNA[1-2]。DNA的制备质量与速度均会对分子实验的效率和准确性造成影响[3]。然而,目前大多数分子生物学实验室主要通过单管取样,进而利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[4]来提取DNA,但研究样品数量大的遗传群体或育种材料时,需要重复操作,效率低下。

目前,现有的快速提取方法有碱裂解法[5]、TE缓冲液研磨法[6],虽然这两种方法都可将DNA提取时间缩短到1小时左右,但提取的DNA的质量常满足不了下游PCR等要求。另一种快速方法是使用一次性聚合物微针贴片刺穿叶片组织,提取细胞内DNA。这适用于植物病害的快速分子诊断,尚难以应用于常规的分子生物学研究中[7]。

虽然已有不少公司可提供商业化的DNA提取服务,先利用常规的植物叶片取样器,将叶片取至96孔深孔板中,再经过自动提取DNA仪器[8-9],但现在还只有96孔板模式,且成本极高。在普通的分子生物学实验室或育种单位,急需开发一种成本低、效率高的植物叶片取样方法,及配套的基因组DNA提取技术流程,可适用于种质资源DNA、基因定位与克隆、分子育种等多种技术。本研究利用384微孔深孔板、吸管、牙签等简单装置,设计了一种可以标准化定量提取大批量植物叶片组织的技术,同时适配开发了改良的CTAB法基因组DNA提取流程,可应用于高通量基因型鉴定等,有利于分子生物学研究人员与分子育种的育种家利用普通的实验室条件开展高通量基因型鉴定工作。

应用本实验技术取样后提取植物基因组DNA, 可提高分子实验研究效率与基因型鉴定效率,通过对比普通单管CTAB法的提取操作时间、提取质量、保存时间,并通过2% 琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增产物验证,发现通过改良取样方法及大规模提取DNA后,可以明显缩短实验时间,加快实验效率,且使用的试剂对操作人员危害相对较低。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用材料为:经过60Co γ射线诱变后的合农75大豆(GlycinemaxL.)大片段缺失突变体QS350与合丰55杂交F2代遗传及衍生群体。

1.2 实验器材

聚丙烯384透明底深孔方型微孔板(每孔容积约为240 μL/孔)(Corning);透明吸管(直径约3.0 mm);牙签;PCR仪(GeneAmp PCR System 9700,Applied Biosystems);水浴锅(HH600,茂祥仪器设备厂);自动联排移液器(E4 XLS,RAININ);离心机(DD-5M,湘仪);回旋式振荡器(HY-5,荣华仪器制造有限公司);超微量分光光度计(Nano Drop 2000c,Thermo Scientific);真空泵(VPA-2,浙航机械有限公司)。

1.3 DNA提取试剂

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,上海生工)溶液;1.5% CTAB;1.4 mol/L NaCl;100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0);20 mmol/L EDTA(4 mL of 0.5 mol Stock/100 mL);1% PVP-40;CIA溶液(氯仿与异戊醇比例为24∶1)。

2 取样方法及提取流程

2.1 取样技术流程

所需取样提取器材如图1所示。高通量基因型鉴定的植物组织取样法大豆叶片取样流程如图2所示。高通量基因型鉴定的植物组织取样法大豆叶片转移及磨样流程如图3所示。

A-磨样用96孔针;B-384深孔微孔板;C-取样吸管;D-取样牙签。图1 所需取样提取器材

图2 大豆叶片取样流程

A-覆盖锡纸的384微孔板;B-将样品送入384板底部;C-将每排取样孔封上;D-研磨样品。图3 大豆叶片转移及磨样流程

根据384深孔微孔板的孔径与高度,选择合适直径的吸管。因本实验中选择的384微孔板的孔直径大小为3.0 mm,所以本实验采用内直径为2.5 mm,外直径为3.0 mm的塑料管(吸管),并统一裁切成长度约为20～30 mm左右,可根据实际情况自行增减长度。

将待取样叶片对折2～3次。左手持叶片样品,右手使用吸管抵住叶片与左手手指,用力挤压将叶片压入吸管内(图2A～F),取样后不影响叶片的后续生长发育;为防止取样时样品被带入其他孔内,取样前先使用铝/锡箔纸覆盖384深孔微孔板,同时压紧以便凸显微孔位置(图3A);使用金属棒或牙签将吸管内叶片推入384深孔内(图3B);每取完一个样品使用酒精棉擦拭手指,清除可能残留的样品;在取完一列样品后,使用胶带将孔贴上,以防取样时对上一列样品出现交叉污染(图3C)。

重复上述操作,直至完成所有叶片的取样。一个 384 样品板完成后,低速离心,使植物样品沉降于植物底部。取完样品后使用真空泵进行干燥并使用自制96孔针进行充分破碎研磨(图3D)。

2.2 DNA提取方法

改良CTAB法,参考武林琳的方法[10]并进行改良。

步骤1(破碎样本):使用上述大豆叶片取样方法取样后,将装有植物叶片的384微孔板放入真空泵中进行抽气干燥,干燥后使用96孔针充分捣碎,破碎细胞壁。

步骤2(裂解细胞及灭酶):向干燥捣碎后的384微孔板每孔中加入75 μL 含有1%β巯基乙醇的2% CTAB溶液,在65 °C的恒温水浴锅中水浴60 min,期间间隔5～10 min缓慢摇晃均匀。

步骤3(提取核酸):冷却至室温后加入75 μL的CIA溶液, 轻轻混匀,4 000 r/min离心30 min。取20～30 μL左右上清液至新的384微孔板内,加入等体积预冷的异丙醇,-20 ℃保存30～60 min后4 000 r/min离心30 min,揭开盖板,铺上吸水纸,反置384微孔板,50 r/min瞬离心上清液。

步骤4(洗涤核酸):向瞬离心后的384微孔板中加入20 μL的70%无水乙醇,室温放置 10 min,4 000 r/min离心10 min,50 r/min倒置瞬离去上清,风干管内溶液。

步骤5(保存核酸):加入10 μL去离子水,完全溶解DNA,即可进行PCR反应。

2.3 PCR扩增反应及电泳

DNA模板准备:利用自动联排移液器取2 μL基因组 DNA转移至384孔PCR板中,每孔的PCR反应液体系包括:2×SanTaq PCR Mix预混酶(Sangon Biotech,上海)5 μL, 第1对PCR引物(含10 μmol·L-1Del-11正向引物与10 μmol·L-1Del-11反向引物)各0.5 μL, 第2对PCR引物(含10 μmol·L-1Del-1021正向引物与10 μmol·L-1Del-1021反向引物)各0.5 μL, 加入灭菌超纯水(ddH2O)至10 μL。

提取的大豆叶片DNA用设计的缺失区间内的与突变表型紧密连锁的引物del-11和del-1021进行PCR扩增。del-11上游引物:CCCATTCGTGTCACTGTCAC;del-11下游引物:AGGTGCACATAGGGGAAGTG;del-1021上游引物:TCCTAAGCAGCTTCCACGAT;del-1021下游引物:CTACGACGAGTTCCTCCGAG。

PCR反应条件为:95 ℃ 预变性 5 min;95 ℃ 变性1 min,59 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,总计33个循环;72 ℃ 延伸7 min;4 ℃ 保存。

电泳及其显色:采用 2%琼脂糖凝胶用SuperRed/GelRed(Biosharp)染色,在Gel Image System Tanon-1600(Tanon)上扫描成像。利用本实验的取样方法进行提取植物基因组DNA,与常规单管CTAB法对比,两种方法结果对比如图4所示。

M为2K DNA Marker;1～4:高通量384板CTAB法(黄化突变体植株);5～8:CTAB单管法(黄化突变体植株);9～12:高通量384板CTAB法(野生型植株);13～16:CTAB单管法(野生型植株)。图4 使用del-11F/R与del-1021F/R两对引物进行PCR鉴定引物多态性

结果表明,使用本实验的取样方法,利用改良后的CTAB法提取的植物基因组DNA效果较好,条带亮度与常规单管CTAB法基本无异,可以鉴别基因型。

3 应用实例及注意事项

本研究建立了一种高通量、高效率提取植物叶片组织DNA的方法,只需利用实验室内常见的工具即可实现同时提取大量DNA的实验要求。所建立的技术方法,每人每日可提取384深孔板4～6板,相当于1 500～2 300个大豆样本,与常用的单管提取法相比,效率显著提高。

在大豆突变体库中[11]M3代中,筛选出一个苗期黄化致死突变分离株行,正常株与突变株的比例为3∶1,经混池测序与BVF-IGV流程分析[12],初步确定候选基因为位于10号染色体的32 338 071 bp～34 915 651 bp区间内约2.6 Mb的大片段缺失。因突变为苗期致死表型,推测分离株行中的正常株中有杂合型突变基因。在分离株行正常株与合丰55进行杂交F2代中,出现了1∶3分离群体,并利用该群体来验证根据大片段缺失由来的分子标记与黄化表型的关联。

按照本研究设计的方法,采集了3个384孔板,共1 150个样本,其中正常表型植株共1 011株,突变表型植株共139株,经本研究所述方法进行DNA提取,经过鉴定,正常表型植株共960株PCR结果为双条带,引物与表型匹配率达94.96%。突变表型植株共138株无条带,1株结果为双条带,鉴定结果引物与表型匹配率达99.28%。通过该方法,成功证明表型与所设计的Indel引物关联,可用于后续定位目的基因。由图5可见,使用两对大片段缺失区间内有200 bp左右差异的Indel引物进行PCR,在高通量鉴定系统中,两引物间不互相影响。

图5 大片段缺失多态性连锁引物鉴定结果

如图5所示,在大片段缺失区间内和缺失区间两端,每隔2 000 bp设计一对引物,使用该方法,我们成功鉴定出多对可以用于后续研究的与表型连锁的多态性引物,成功将Indel分子标记与表型紧密关联起来。

4 结语

如何快速标准取样及如何高通量提取DNA一直是制约植物、作物分子鉴定的关键步骤[13]。本研究提出的高通量叶片标准取样法及DNA提取鉴定技术,适用多种植物及作物,使用384微孔深孔板及吸管即可完成标准化定量取样工作,同时应用改良的武林琳的CTAB法[10]进行DNA提取,一至两小时即可提取数个384深孔板,且片段完整,PCR扩增效果较好,且结果准确。与传统单管式CTAB法相比,本方法操作简单,步骤少,耗时短,使用氯仿等有毒有害有机溶剂量少,所需样本量低,对植物损伤较小,可大幅度节约实验时间和成本,对于植物分子标记及快速DNA检测研究具有重要应用价值。