Box-Behnken响应面法结合熵权法优化三黄洗剂提取工艺

刘龙云,王晓权,2,孙 松,白中稳,戴若萌,何晓丽

(1.合肥职业技术学院生物工程学院,安徽 合肥 238000;2.合肥师范学院化学与化学工程学院,安徽 合肥 230000;3.合肥远志医药科技开发有限公司,安徽 合肥 230000)

三黄洗剂收载于《中医外科学》,处方由大黄、黄柏、黄芩、苦参四味中药组成,具有清热止痒、保护收敛的作用,治疗各种急性无渗出性皮炎、单纯性皮肤瘙痒。其临床主要用于治疗小儿皮肤念珠菌病、皮肤湿疹样病变、带状疱疹、急性生阴部湿疹、寻常型脓疱疮、尖锐湿疣、皮炎、湿疹、疖病、蚊蚤叮咬,伴有红肿焮痒,或有少量渗液等[1-4],临床疗效确切,应用于临床多年,是多家医院的院内制剂。通过文献调研,我们发现关于三黄洗剂的制法较为传统,现代提取工艺研究较少,阻碍其进一步开发利用。

Box-Behnken设计-响应面法(Box-Behnken design-response surface methodology,BBD-RSM)是近年来广泛应用的多实验条件优化的方法[5-9],通过建立多元回归方程拟合因素和效应值之间的函数关系。相较于单因素实验与正交实验,响应面法优点在于利用最少的实验组数对实验条件进行优化,有效地提升了提取效率。

本研究在单因素实验确定三黄洗剂提取条件的基础上,以小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的质量浓度为考察指标,用熵权法结合BBD-RSM法对三黄洗剂的提取工艺进行优化,以期实现三黄洗剂中有效成分的高效提取,为其进一步开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 试药与仪器

大黄、黄柏、黄芩、苦参(购于安徽省中医院);大黄素(批号110756-201913)、盐酸小檗碱(批号110713-202015)、黄芩苷(批号110715-202223)、汉黄芩苷(批号112002-201702)、苦参碱(含量测定用,批号110805-202010),对照品来自于中国食品药品检定研究院;甲醇色谱纯(美国阿斯顿化学技术有限公司),磷酸(成都市科隆化学品有限公司),乙醇(国药集团化学试剂有限公司),纯化水(娃哈哈集团(杭州)有限公司)。

Waters2695-2996高效液相色谱仪(Waters有限公司);ChromCore C18(250 mm×4 mm,5 μm)色谱柱(北京英莱克科技发展有限公司);HH-2数显恒温水浴锅(金坛市富华电器有限公司);梅特勒-托利多分析天平MF-MS105梅特勒-托利多集团);GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司);RS-FS1401粉碎机(合肥荣事达小家电有限公司);WE-H3-18K台式高速离心机(苏州威尔实验用品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

将大黄、黄柏、黄芩、苦参分别粉碎,过3号筛,浸出物测定时过2号筛,备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

1.2.2.1 小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素

精密称取小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的对照品适量,加入甲醇后进行超声处理,直至完全溶解,制成质量浓度分别为0.816、0.544、0.808、0.086 mg/mL的混合对照品溶液,0.48 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得[10]。

1.2.2.2 苦参碱

精密称取苦参碱对照品适量,加甲醇超声处理至完全溶解,制成质量浓度为1.046 0 mg/mL的苦参对照品溶液,使用0.48 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得苦参碱对照品溶液[11-12]。

1.2.2.3 供试品溶液

取制备的样品粉末各2 g于锥形瓶中,加乙醇溶液100 mL,摇晃使药粉全部润湿,恒温水浴锅中加热提取,提取液以4 000 r/min的转速离心3 min后,取上层清液,用0.48 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液,即为苦参供试品溶液。

1.2.2.4 阴性对照溶液制备

按照比例分别称取三黄洗剂处方的大黄、黄柏、黄芩、苦参这四味药材各3份,制成不含大黄、不含黄芩、不含黄柏、不含苦参的阴性样品,并按“1.2.2.3”步骤操作,制得阴性样品溶液。

1.3 小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素含量测定

1.3.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B);洗脱梯度:(0～20 min,10%A→37%A;20～30 min,37%A;30～31 min,37%A→38%A;31～36 min,38%A;36～50 min,38%A→65%A;50～80 min,65%A→100%A),体积流量1.0 mL/min;检测波长265 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL[13-17]。

1.3.2 专属性考察

按照“1.3.1”色谱条件,精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL注入高效液相色谱仪,分析溶剂、混合标准品、供试品溶液和阴性对照品溶液在波长264 nm条件下的HPLC色谱图。

1.3.3 线性考察

精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL,按“1.3.1”中色谱条件进样测定。以质量浓度对色谱峰的峰面积进行线性回归,绘制小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素的标准曲线。

1.3.4 精密度考察

取“1.2.2.1”中同一混合对照品溶液,重复进样5次,计算RSD。

1.3.5 稳定性考察

按照“1.2.2.3”方法制备供试品溶液,于0、2、4、8、12 h进样,计算RSD。

1.3.6 加样回收率考察

精密量取已知质量浓度的6份样品溶液各2 mL,置10 mL容量瓶中,加入适量混合对照品溶液,混合均匀,按“1.2.2.3”方法制备供试品溶液,按“1.3.1”中色谱条件进样检测,以峰面积为统计指标,分别计算各成分的平均回收率和RSD。

1.4 苦参碱含量测定

1.4.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-[0.01 mol/L乙酸铵溶液(浓氨试液调pH为 8.1)](V∶V=3∶2)为流动相A,0.01 mol/L乙酸铵溶液(浓氨试液调pH为8.1)为流动相B,洗脱梯度(0～20 min,10%A→30%A;20～40 min,30%A→40%A;40～50 min,40%A→60%A),体积流量1.0 mL/min,检测波长225 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL[18]。

1.4.2 专属性考察

按照“1.4.1”中色谱条件,精密吸取溶剂、对照品溶液、供试品溶液各10 μL 注入液相色谱仪,观察供试品溶液中待测成分与对照品在相同的保留时间是否有对应的色谱峰。

1.4.3 线性关系

按照“1.2.2.2”方法,精密称取苦参碱标准品适量,用甲醇稀释,以峰面积Y对苦参碱质量浓度作回归方程。

1.4.4 精密度考察

取“1.2.2.2”步骤的对照品溶液,重复进样5次,计算峰面积的RSD。

1.4.5 稳定性考察

按照“1.2.2.3”方法制备供试品溶液,于0、2、4、8、12 h进样,计算峰面积的RSD。

1.4.6 加样回收率考察

精密量取已知含量的6份样品溶液各2 mL,置于10 mL容量瓶中,加入适量的混合对照品溶液,混合均匀,按“1.2.2.3”中方法制备供试品溶液,按“1.4.1”中色谱条件进样,计算平均回收率和RSD。

1.5 提取工艺研究

1.5.1 综合评分计算

熵权法[19-21]是根据多项指标所提供的信息确定各指标的权重。信息熵Ej表示体系的混乱程度。熵值越小,其权重越高,在综合评价中所起作用也越大,具体计算方法如下:

①用公式(1)对数据归一化处理。

(1)

②利用公式(2)、(3)、(4)计算出各指标的信息熵Ej。

(2)

k=1/lnm,

(3)

(4)

其中,Pij为第j个指标下第i组的概率,0≤Pij≤1,k为样本数对数的倒数,m为实验的样本数。

③用公式(5)计算出权重系数Wj。

(5)

1.5.2 单因素实验

1.5.2.1 提取温度

按处方配比取所需药材适量,以提取时间90 min、乙醇浓度50%为固定量,考察不同提取温度下,小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的质量浓度变化,结合综合评分法优选最佳提取温度。

1.5.2.2 乙醇浓度

按处方配比取所需药材适量,以提取时间90 min、提取温度55 ℃为固定量,考察不同乙醇浓度下,小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的质量浓度变化,综合评分法优选最佳乙醇浓度。

1.5.2.3 提取时间

按处方配比取所需药材适量,以提取温度55 ℃、乙醇浓度50%为固定量,考察不同提取时间下,小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的质量浓度变化,在90 min之后,选择最佳提取时间。

1.6 Box-Behnken响应面法

本研究在前期预实验中,发现提取温度(X1)、乙醇浓度(X2)、提取时间(X3)对三黄洗剂提取工艺综合评分影响显著,故本实验以X1、X2、X3为考察因素,采用 Design Expert 8.0.6 软件设计3因素3 水平Box-Behnken响应面法实验方案。以小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的质量浓度的综合评分Z1、Z2、Z3、Z4、Z5为因变量,采用熵权法综合评分法优选三黄洗剂提取工艺,计算综合评分(Z)。

1.7 验证实验

按照最佳工艺条件进行3次验证实验,并进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素含量测定

2.1.1 专属性考察结果

混合标准品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液的HPLC色谱图见图1。由图1可知,供试品溶液中待测成分与对照品在相同的保留时间有对应的色谱峰。

(a)混合标准品 (b)供试品

(c)大黄阴性 (d)黄芩阴性

(e)苦参阴性 (f)黄柏阴性峰1-小檗碱;峰2-黄芩苷;峰3-汉黄芩苷;峰4-大黄素。图1 混合标准品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液的HPLC色谱图

2.1.2 线性考察结果

分别绘制各对照品的标准曲线。各对照品的回归方程、相关系数r、线性范围见表1,结果表明各成分在相应质量浓度范围内线性关系良好。

表1 小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素的线性关系

2.1.3 精密度考察结果

小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素对应峰面积的RSD分别为1.05%、1.12%、1.33%、1.26%,结果表明仪器精密度良好。

2.1.4 加样回收考察结果

小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素加样回收率结果见表2,符合方法学要求。

表2 小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素加样回收率结果(n=6)

2.2 苦参碱含量测定

2.2.1 专属性考察结果

供试品溶液中待测成分与对照品在相同的保留时间有对应的色谱峰。

2.2.2 线性关系结果

绘制对照品标准曲线,峰面积Y对盐酸小檗碱质量浓度回归方程:Y5=3 474 968.657 53X-155 42,r=0.999 6,在209.2～1 046.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度考察结果

重复进样5次,峰面积的RSD为2.07%。结果表明仪器精密度良好。

2.2.4 加样回收率考察结果

苦参加样回收率结果见表3,符合方法学考察。

表3 苦参加样回收率结果(n=6)

2.3 综合评分计算结果

应用熵权法计算得到小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄素、苦参碱的权重值分别为 0.226、0.233、0.175、0.258、0.107。综合评分Y=0.226Z1+0.233Z2+0.175Z3+0.258Z4+0.107Z5,其中,Z1为小檗碱的质量浓度,Z2为黄芩苷质量浓度,Z3为汉黄芩苷质量浓度,Z4为大黄素质量浓度,Z5为苦参碱质量浓度。计算不同实验组别各指标成分综合评分。

2.4 单因素实验结果

提取时间、提取温度、乙醇浓度对综合评分的影响结果如图2(a)～(c)所示。

(a)提取时间 (b)提取温度 (c)乙醇浓度图2 提取时间、提取温度、乙醇浓度对综合评分的影响

2.5 Box-Behnken响应面法实验结果

工艺优化实验因素水平、实验方案与结果见表4。

表4 Box-Behnken实验设计与响应值

采用 Design Expert 8.0.6软件将各组综合评分数据进行多元回归和二项式分析,对3个因素的二次回归模型方程建立综合评分:

F=5.75+0.153 7X1+0.068 8X2+0.112 5X3+0.047 5X1X2+

对回归模型进行方差分析,结果见表5。

表5 Box-Behnken设计方差分析结果

图3 提取温度、提取时间、乙醇浓度与提取功率交互作用对综合评分影响的等高线图和响应面图

2.6 验证实验结果

根据模型拟合结果,提取温度为56.4 ℃,提取时间为93.9 min,乙醇浓度为71.5%,按照最佳工艺条件进行3次验证实验,并进行含量测定。如表6所示,验证实验综合评分均值为5.84,与理论最佳工艺样品的综合评分5.80基本吻合,说明优化得到的提取工艺条件较为稳定可行。

表6 验证实验结果

3 讨论

中药复方组分较多,不同的加工工艺对复方质量有很大的影响[21]。液体制剂具有体积大、运输携带不方便的特点,可通过优化中药复方的提取工艺,将提取液浓缩为浓缩液、浸膏或粉末,进而制成其他制剂,方便使用。中药复方工艺优化的评价方法是学者们一直在探索的问题,王锐等[22]以桑皮苷A、指纹图谱相似度、出膏率以及地骨皮乙素为评价指标,通过模糊层次分析法(fuzzy analytical hierarchy process,FAHP)-熵权法结合基准关联度确定各指标权重系数,计算综合评分,优化经典名方泻白散的提取工艺;李婉玉等[23]以总多糖、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的含量,及浸膏得率为评价指标,采用AHP结合熵权法确定权重系数,以多指标综合加权评分法优化复方红黄咀嚼片提取工艺;张星等[24]利用多元统计分析对指纹图谱 共有峰数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)与正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)并计算得分,优化经典名方四妙勇安汤煎煮工艺。

本实验建立RP-HPLC检测方法,以三黄洗剂中五种代表性成分为评价指标,先进行单因素实验确定因素的考察范围,再通过Box-Behnken响应面法考察因素之间的交叉影响,结合熵权法进行综合评分,优化三黄洗剂提取的工艺参数。实验结果表明,提取温度56.4 ℃,提取时间93.9 min,乙醇浓度71.5%,综合评分为5.84,与模型理论预测值基本一致,表示该模型准确度可信,质量稳定,能够较合理地应用于三黄洗剂提取的工艺优化,为中药复方的制剂研究提供参考。