臭氧微纳米气泡在食品杀菌中的应用

周 辉，徐华兴，高亚飞，徐宝才

（1.合肥工业大学 食品与生物工程学院，合肥 230000；2.安徽禾丰食品有限责任公司，安徽亳州 236000）

0 引言

微纳米气泡（MNBs）是指将气体分散在溶液中，形成的微米级（＜100 µm）和纳米级（＜1 µm）的微小气泡颗粒［1］。MNBs 具有比表面积大、稳定性强、气液传质效率高和易于产生自由基等理化特性，目前被广泛应用于农业、水产养殖业和环境污染治理等领域［2-3］。

臭氧具有强大的氧化、抗菌和抗病毒能力，对包括细菌、病毒、原生动物和内生孢子在内的病原体具有极好的灭活能力。食品中的臭氧化是一种不改变营养、感官和物理化学特性的绿色杀菌技术，有利于保持食品的质量和安全性［4］。然而臭氧的高度不稳定性以及臭氧杀菌副产物的毒性数据还未研究清楚，是臭氧杀菌应用的主要限制［5］。

微纳米气泡与臭氧的结合提高臭氧在水中的溶解度，并极大减少臭氧的损失［6］，从而提升臭氧的处理效率。基于此特性，臭氧微纳米气泡（OMNBs）技术已经广泛应用于污水处理、水产养殖和农业种植等领域［7-9］，然而在食品杀菌领域的研究和应用还比较少。因此本文围绕MNBs 的基本性质、制备方法、表征方法，以及OMNBs 的特性、影响因素，及其在食品杀菌中的应用进行阐述，以期为OMNBs 在食品杀菌领域中的应用提供参考，促进其发展。

1 微纳米气泡

1.1 理化特性

不同尺寸大小的气泡拥有不同的性质。相较于普通大气泡，MNBs 具有比表面积大、在水中留存时间长、气液传质效率高、Zeta 电位高以及破裂后产生羟基自由基等特点。

1.1.1 比表面积大

MNBs 的比表面积定义为气泡的表面积与体积之比，通过式（1）计算。MNBs 的直径越小，比表面积越大［10］。由于比表面积的大小影响MNBs 的气液界面面积和稳定性，因此是保持MNBs 稳定性和功能性的重要物理参数。

式中 SSA——比表面积，m2/m3或1/m；

d——MNBs 的直径，m。

1.1.2 留存时间长

MNBs 在水中的浮力Fb根据浮力公式（2）计算。在溶液中，气泡直径越小，受到的浮力越小，上升速度越慢。因此，MNBs 在溶液中由于其低浮力而停留时间较长［11］。其上升过程如图1 所示。

图1 普通大气泡与微纳米气泡上升过程的比较Fig.1 Comparison of rising process of ordinary large bubbles and MNB

式中 dp——气泡直径，m；

ρ1——溶液密度，kg/m3；

ρp——气泡中气体的密度，kg/m3；

g——重力加速度，m/s2。

1.1.3 传质效率高

根据气液界面表面张力理论，气泡直径越小，表面张力对气泡的影响越明显。溶液体系内，MNBs 内部压力与气泡直径或大小的关系如Young-Laplace 方程（3）所示［12］。MNBs 的直径非常小，从而受到较大的表面张力，使其直径不断缩小，并使气泡内部压力增大。当收缩过程达到某个极限值时，气泡内部气压将趋于无限大，最终导致气泡溶于水或破裂［13］。在此过程中，因为MNBs 具有较大的比表面积，即使水体中气体溶解率达到过饱和状态，仍可实现气液传质并具有较高的传质效率。

式中 Pin——内部气相压力，Pa；

Pout——液相压力，Pa；

γ——气液表面张力，N/m；

r——气泡半径，m。

1.1.4 Zeta 电位高

Zeta 电位是胶体粒子在电场作用下运动时，在滑动或剪切面上的电动势，是关系到胶体体系稳定性的重要粒子表面特性［14］。研究结果表明，水中MNBs 表面主要是以OH-为主，因此带负电荷［15］。当MNBs 收缩时，气泡表面离子的吸附和内表面反离子的产生共同作用形成高界面Zeta电位。当Zeta 绝对值较高时，MNBs 表面电荷产生的排斥力抑制气泡的聚集，从而使得液体体系中MNBs 具有高度稳定性［16］。

1.1.5 羟基自由基的生成

MNBs 破裂瞬间产生羟基自由基，羟基自由基具有非常高的氧化还原电位，因此MNBs 具有很强的杀菌能力［17］。由Young-Laplace 方程可知，MNBs 的内压远高于大气压，在气液界面因气泡破裂而消失的瞬间，积聚在气液界面上的高浓度带电离子瞬间释放出大量能量，进而产生羟基自由基［18］。

1.2 制备方法

一种低成本、简易、高效、成熟和稳定的制备方法以及制备技术是研究和应用MNBs 的重要条件。目前制备MNBs 的方法根据其产生原理主要分为3 类，即空化、电解和应用纳米孔膜。

1.2.1 空化法

MNBs 在溶液中的形成、产生和破裂过程常被称为空化。根据产生方式，空化大致可分为以下4 类［19］。

流体动力空化是通过改变系统几何形状，引起运动流体的压力变化，从而发生汽化并产生气泡［20］。文丘里发生器是基于流体动力空化原理的MNBs 发生器［21］，利用该装置生成OMNBs 的流程如图2 所示。流体动力空化具有设备简单、维护成本低等优点，是目前生成MNBs 最经济、最节能的方式之一。

图2 文丘里喷射器生成臭氧微纳米气泡的实验装置Fig.2 Experimental setup for generating ozone micro- and nanobubbles by Venturi injector

声空化是通过在液体中传播超声波，导致压力变化从而形成MNBs［22］。

光学空化是通过高强度光束（短脉冲激光）射入液体中而产生MNBs。

粒子空化是通过水中的基本粒子穿过液体中的高强度光子产生MNBs。

1.2.2 电化学法

电化学法通过电解水在阳极和阴极上产生氢气和氧气，当电极上的氢气和氧气达到饱和状态时产生MNBs。ZHU 等［23］使用ec-H2O 纳米清洗设备电解氯化钠溶液，成功制备直径约为100 nm且在溶液中稳定存在了24 h 的MNBs。

1.2.3 纳米孔膜法

纳米孔膜法是利用纳米孔膜作为气体和液体分散的介质，气体通过纳米孔膜进入液体，纳米孔膜对气体进行压缩而产生MNBs。AHMED 等［24］利用管状陶瓷纳米滤膜注入空气、氮气和氧气从而生成纳米气泡，并且发现，膜孔大小和表面能对纳米气泡的尺寸大小和Zeta 电位有明显的影响。

1.3 表征方法

微纳米气泡的尺寸＜100 µm，并且在一般情况下透明。因此，区分液体中MNBs 和固体纳米颗粒、纳米油滴等胶体分散物较为困难，故有效的尺寸测量方法至关重要。目前主要有以下几种常用的表征方法。

1.3.1 动态光散射

动态光散射是测量MNBs 尺寸最常用的方法，测量范围为0.5 nm～6 µm。当激光照射MNBs的悬浮液时，使用快速光子探测器在散射角θ处探测散射光的波动。因为粒子遵循布朗运动，所以尺寸大的粒子产生较大的散射并且波动较慢。通过对波动强度的分析就可以得出MNBs 的尺寸大小［25］。

1.3.2 纳米粒子跟踪分析

纳米粒子跟踪分析技术是通过暗场显微镜捕捉不同粒径的颗粒在溶液中的运动［26］，并根据布朗运动的斯托克斯-爱因斯坦关系分析它们的轨迹，以确定其尺寸大小。该技术检测颗粒大小的范围在10～1 000 nm。

1.3.3 共振质量测量

共振质量测量是一种利用独特的微电子机械系统谐振器，通过测量频率变化来检测粒子浮力的技术［27］。该技术不仅可以解决其他传统技术在区分100～200 nm MNBs 时的缺陷，而且能够区分浮力粒子（气泡）和非浮力粒子（固体）［28］，是一种测量MNBs 尺寸的创新性技术。

1.3.4 光学图像分析

光学图像分析主要是通过高倍显微摄像机进行拍摄，再利用计算机通过拍摄的图片测量MNBs的尺寸［29］。虽然光学图像分析对于验证MNBs的存在具有优势，但是由于不能同时测量大量气泡，从而无法提供MNBs 尺寸的精确值［30］。

除此之外，测量MNBs 尺寸的方法还有Zeta 电位分析仪、数字全息显微镜和光谱技术等［31-33］。

2 臭氧微纳米气泡

2.1 臭氧杀菌局限性

臭氧是一种强氧化性气体，在20 世纪初用于饮用水的消毒之后，开始在食品加工领域应用［34］。然而臭氧杀菌也存在着局限性：首先，虽然臭氧在水中高度不稳定，不会留下残留的消毒剂，但是也限制了其在二次消毒中的有效性；其次，臭氧可将溴化物氧化成溴酸盐［35］，这是一种已知的致癌物；最后，臭氧与天然有机物反应生成有机臭氧杀菌副产物，目前对这些副产物的毒性数据还未研究清楚［36］。

2.2 臭氧的杀菌机制

臭氧的抗菌能力主要是由于其对自由基的高氧化电位。臭氧分子与可氧化的细胞成分反应，引起抑制微生物生长的氧化反应，导致细胞损伤或微生物死亡。臭氧杀菌过程中主要反应如下式［37］：

目前，针对臭氧的杀菌作用已经提出2 种重要的机制：一是多肽、蛋白质和酶巯基被臭氧氧化，产生小分子肽；二是多不饱和脂肪酸的氧化形成酸性过氧化物［38］。细胞膜中不饱和脂肪酸的降解使得细胞裂解，从而导致微生物失活。此外，核酸的严重损伤以及细胞蛋白质的广泛氧化也会导致微生物快速死亡［39］。

2.3 臭氧与微纳米气泡的结合

2.3.1 臭氧溶解度的提高

传统的臭氧化主要通过臭氧在水中的溶解，但是会使臭氧大量逸出导致消耗量非常大。当MNBs用于溶解臭氧时，臭氧的溶解量会有明显的提高，因此臭氧的杀菌能力也会有明显的增强［40］。HU等［41］研究发现，在气泡产生30 min 内，MNBs 中臭氧的溶解浓度最高值达到（10.09±0.09）mg/L，而毫米级气泡中臭氧的溶解浓度最大值为0.64 mg/L。

2.3.2 臭氧化负面效果的抑制

温度的升高会降低臭氧在水中的溶解度，低pH 值条件下臭氧化效率也会受到抑制，而MNBs能够抑制pH 值和温度对臭氧化效率的负面影响。TEMESGEN 等［42］研究显示，温度从19 ℃升高到25 ℃时，与传统臭氧化相比，臭氧在纳米气泡中的溶解度增加；在酸性条件下，随着pH 值的升高，OMNBs体系中产生的羟基自由基比传统臭氧化更多。

2.3.3 臭氧传质系数的增强

MNBs 曝气相较于大气泡可以增强臭氧的传质系数。FAN 等［43］研究结果表明，纳米气泡曝气的臭氧传质系数为0.179 min-1，溶解的臭氧浓度为13.4 mg/L，分别是大气泡曝气（0.038 min-1和7.9 mg/L）的4.7，1.7 倍。GAO 等［44］研究发现，在0～10 min，臭氧在微米气泡体系中的传质系数是0.023 4 min-1，而在传统的大气泡体系中是0.005 5 min-1。

2.3.4 臭氧半衰期的延长

MNBs可以有效延长臭氧在水相中的半衰期。最近的一项研究表明，臭氧在纳米气泡体系中的半衰期是大气泡中的23 倍［45］。臭氧半衰期延长的原因可能是因为气泡的排斥理论［46］。

MNBs 的利用可以提高臭氧的溶解度并极大地减少臭氧用量，显著增强臭氧的利用效率。

2.4 臭氧微纳米气泡的影响因素

对于OMNBs，稳定性是影响臭氧溶解性的重要因素。而OMNBs 稳定性的主要影响因素如下。

2.4.1 温度

温度是影响OMNBs 稳定性的一个关键因素。ALUTHGUN 等［47］研究结果表明，随着温度的升高，臭氧纳米气泡的尺寸随之增加，Zeta 电位随之降低。Zeta 电位的降低可能是由于随着温度的升高，溶液中离子的迁移率更高，气泡表面的OH-浓度降低所致。

2.4.2 pH 值

溶液pH 值对OMNBs 的Zeta 电位同样具有较大影响。一般气泡的Zeta 电位在高酸性溶液中为正值。ZHENG 等［48］研究结果表明，当 pH为8.0 时，OMNBs 的Zeta 电位约为-33 mV；而当pH 降至7.0 时，Zeta 电位仍高于-20 mV。在高pH 值条件下，OMNBs 的稳定性更高，主要是因为气液界面处吸附的OH-增加，并且臭氧的分解速率也会加快。因此为了达到相同的氧化还原电位，需要产生更多的MNBs。

2.4.3 盐浓度

溶液盐浓度不仅影响OMNBs 的Zeta 电位，还影响气泡尺寸的大小。MEEGODA 等［49］研究结果表明，OMNBs 的Zeta 电位均为负值，并且随着NaCl 浓度的增加而降低，而其气泡直径随着NaCl 浓度的增加而增加。

3 臭氧微纳米气泡在食品杀菌中的应用

3.1 水处理

臭氧是非常有效的消毒剂，可有效杀灭导致水传播疾病的病原体，是饮用水消毒的主要方法之一。而臭氧在水中快速分解并且臭氧化可能会产生副产物，是其用于饮用水消毒的主要缺点。因此在臭氧的基础上，引入MNBs 用于饮用水消毒，可以有效改善该工艺的效率。因为MNBs 的加入不仅可以降低臭氧的降解速率，还可以提高臭氧的溶解度，从而减少臭氧杀灭病原体的投加量。

JYOTI 等［50］研究结果表明，与单独的物理处理技术相比，流体动力空化和臭氧化的结合在成本和杀菌性能方面更加优越。虽然单独臭氧处理的成本更低，但是混合方法在提高处理效率的同时降低了臭氧化副产物的形成。SINGH 等［51］研究发现，通过流体动力空化技术产生的OMNBs可以有效杀灭水中的微生物，对饮用水进行杀菌。因为MNBs 不仅可以维持臭氧的高溶解度，并且产生的自由基引起的氧化反应也加速了微生物的灭活。KARAMAH 等［52］研究表明，臭氧化和流体动力空化的组合对大肠杆菌的灭活效率更高，细菌浓度在45 min 由105 CFU/mL 下降至0，而单独使用臭氧化或者流体动力空化的灭活时间为60 min，充分展示出臭氧化和流体动力空化的组合在大肠杆菌灭活方面的性能。

利用OMNBs 进行饮用水杀菌时，在维持较高的传质效率的同时又使用更低的臭氧量，并且降低臭氧消毒副产物的生成，在水处理领域具有良好的应用前景。

3.2 果蔬清洗

果蔬在生长期间易感染水和土壤等因素带来的微生物，并且在采摘、运输和生产加工过程中易被微生物污染从而影响贮存期［53］。利用OMNBs水清洗果蔬属于气泡清洗方式。气泡清洗方式是一种对果蔬损伤较小的方法。与传统气泡清洗方式不同，OMNBs 直径更小，可以对果蔬的细微处进行更有效的清洗。此外，OMNBs 还具有强氧化性，不仅可以快速杀灭果蔬表面的细菌、病毒和虫卵等，还可以分解果蔬表面的农药残留，从而延长果蔬的储存时间，提高食用安全性，并且臭氧会分解为氧气，不会在果蔬表面残留，因此该方法是一种安全高效的清洗方式。

HOU 等［54］研究OMNBs 水对番茄上的肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的灭活程度，结果显示，OMNBs 水可有效杀灭番茄上的细菌，并且细菌数量显著低于臭氧水处理的对照组，此外OMNBs 水处理之后对番茄的颜色、质地和感官特征都无明显影响。USHIDA 等［55］研究表明，与含次氯酸钠的MNBs处理相比，OMNBs 交替流动处理使白菜样品的活菌数大约降低了1 个数量级。王雪青等［56］研究结果表明，OMNBs 处理可以有效保证细胞的完整性，并且延缓VC 和叶绿素含量的下降，通过抑制细胞呼吸和乙烯的释放提高菠菜的耐贮性，提高抗氧化酶的活性，从而达到保鲜的效果。

此外，OMNBs 可以有效降解果蔬中的农药残留，从而降低农药残留在果蔬加工过程中对人体健康的影响。LI 等［57］研究表明，与自来水、次氯酸水、臭氧水和微米气泡水相比，OMNBs 水处理苹果样品，对敌百虫和丁硫克百威的去除效果更好。此外有研究表明，OMNBs 处理对缸豆上5 种农药残留的去除率比臭氧大气泡处理高15%～47%。

OMNBs 对果蔬采后食用安全性的提高以及保鲜贮存时间的延长表现出巨大的潜力。

3.3 水产品杀菌

水产品中含有丰富的营养物质，在全球食品供应中发挥着至关重要的作用。水产品受到污染与许多病原体有关，由此引起的食品安全问题一直是社会关注的热点［58-59］。因此，有效的病原体杀灭方法是保证水产品安全的重要途径，而OMNBs 可以有效杀灭病原体，是一种非常具有前景的方法。

NGHIA 等［60］研究结果显示，臭氧纳米气泡处理2，4，6 min 后，细菌浓度分别为原先的23%，2.2%，0%。JHUNKEAW 等［61］研究结果表明，臭氧纳米气泡单一处理10 min，可使无乳链球菌或维氏气单胞菌的细菌载量降低96.11%～97.92%，并且使用臭氧纳米气泡对罗非鱼处理10 min，在48 h之后未观察到死亡。IMAIZUMI 等［62］使用960 mV氧化还原电位的海水对副溶血性杆菌进行杀菌试验，结果显示，在处理1 min 后，超过99%的细菌被杀灭；在处理5 min 之后，杀菌效率达到100%，表明臭氧纳米气泡具有很强的杀菌效率。

除了臭氧杀灭致病菌之外，KURITA 等［63］还报告了臭氧纳米气泡对小型寄生浮游甲壳类动物的杀灭效果，这些生物是水产品中主要的致病性甲壳动物，结果表明，相对于未处理组，臭氧纳米气泡处理25 min 减少了63%的寄生浮游甲壳类动物，并且该处理对海参和海胆都安全。

OMNBs 对鱼类致病菌和致病性甲壳动物具有很强的杀灭效果，为OMNBs 在水产品中的应用提供了研究基础。

4 结语

本文介绍了MNBs 的性质、制备和表征方法以及OMNBs 的特性、影响因素，及其在食品杀菌领域中的应用。相比于普通气泡，MNBs 表现出更高的稳定性、气体溶解性和传质效率，MNBs 破裂可产生羟基自由基，因此使其具有很强的杀菌能力。OMNBs 技术克服了臭氧残留、杀菌能力弱和臭氧溶解度低导致臭氧使用量大的缺点，有效降低臭氧杀菌工艺的运行和维护成本，并且臭氧用量大幅降低，比传统技术也更加环保。

目前OMNBs 的研究处于起步阶段，还存在较多欠缺。首先，OMNBs 的特性与气泡尺寸密切有关，因此开发数量和尺寸精准的制备方法尤其重要；其次，需要开发MNBs 的快速表征方法，以快速检测MNBs 的数量和尺寸；最后，有必要进一步探索OMNBs 在食品杀菌领域的应用，进一步研究其作用机理。OMNBs 技术在食品杀菌领域表现出了巨大的潜力，有待进一步研究。