火焰原子吸收光谱法测定牛乳中钙含量的不确定度评定

邢益俊，刘传栩，杨爱君，何 瑛，纪坤发

广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 510507

0 引言

钙是人体含量最多的矿物质元素，也是骨骼健康不可缺少的元素，适当补充钙能促进青少年生长发育，预防中老年骨质疏松、牙齿松动和心血管疾病[1]。牛乳含丰富的钙，很容易吸收，是人体补充钙的最佳选择之一[2]。市场中乳制品品类多样，消费者也比较关注营养成分含量。钙作为重要的营养指标之一，乳中钙含量是实验室日常检测的重要项目。如何准确检测乳中钙含量，是实验室工作人员首先考虑的问题。受环境、仪器设备和人员操作方法等多因素影响，可能导致测量结果不准确和误差[3]。测量不确定度是测量系统最基本、最重要的特性指标，是测量结果的重要标志。测量不确定度越小，说明测定结果越准确[4，5]。

本试验采用GB 5009.92—2016《食品安全国家标准_食品中钙的测定》标准中第一法，用火焰原子吸收光谱法测定牛乳中钙含量。该方法灵敏度高，检测结果准确、快速，是目前测定牛乳中钙含量最常用方法之一[6]。按照CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[7]和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[8]评定试验的不确定度，分析与评定牛乳中钙含量检测结果带来不确定度的关键因素，为检测结果准确性和可信度提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

生牛乳，来源自阳江红五月良种奶牛场。

1.2 试剂

钙单元素溶液标准物质（1 000 μg/mL），购自中国计量科学研究院；硝酸（65%，优级纯），购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氧化镧（4N，高纯），购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯），购自广州化学试剂厂；试验用水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规则和试验方法》中规定的一级水。

1.3 仪器设备

Aanalyst原子吸收光谱仪（配有钙空心阴极灯），美国珀金埃尔默公司；Multiwave PRO微波消解仪，安东帕（上海）商贸有限公司；赶酸机，上海博通化学科技有限公司；Mili-Q超纯水系统，美国Millipore公司；单道移液器和容量瓶（A级），德国Brand公司；METTER TOLEDO 204T电子天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 检测原理

牛乳试样经微波消解仪消解后，加入氧化镧溶液作为释放剂，定容，直接吸入空气-乙炔火焰中原子化，在422.7 nm处测定共振线，在一定范围内钙含量与吸收值成正比。

1.4.2 检测过程

使用火焰原子吸收光谱法测定牛乳中钙含量的步骤见图1。

图1 火焰原子吸收光谱法测定牛乳中钙含量

1.4.3 试剂及标准曲线配制

氧化镧溶液（50 g/L）配制：称取29.32 g氧化镧于干净烧杯中，用少量水湿润后加入125 mL盐酸溶解，转入500 mL容量瓶中，多次用一级水润洗烧杯，逐一转入容量瓶中，定容至500 mL，摇匀备用。

钙溶液标准储备液（50 μg/mL）配制：用5 mL移液器准确吸取钙单元素溶液标准物质（1 000 μg/mL）2.5 mL于50 mL容量瓶中，用一级水定容至50 mL摇匀备用。

钙溶液标准曲线工作液配制：用移液器准确吸取钙溶液标准储备液（50 μg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL氧化镧溶液，再加入1 mL硝酸，用一级水定容至50 mL，配制浓度0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

1.4.4 样品制备

准确称取牛乳0.25 g于微波消解内管中，加入5 mL硝酸，缓慢旋紧螺盖，按照微波消解仪程序步骤消解（表1）。冷却后取出消解内管，置于赶酸机中140 ℃赶酸至约剩1 mL，待消解液冷却后转移至100 mL容量瓶（A级）中，用一级水冲洗内盖，一并转移至该容量瓶中，再加入4 mL氧化镧（50 g/L）溶液，最后用一级水定容至100 mL刻度，混匀备用，同时做空白试验。

表1 微波消解仪程序步骤

1.4.5 检测仪器工作条件参数设定

原子吸收光谱仪工作条件参数见表2。

表2 原子吸收光谱仪工作条件参数

1.4.6 检测结果计算

根据GB 5009.92—2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》，该方法的计算数学模型：

式（1）中：

X—试样中钙的含量，单位mg/100 g；

p—试样待测液中钙的质量浓度，单位mg/L；

p0—空白溶液中钙的质量浓度，单位mg/L；

f —试样消化液的稀释倍数为1：

100、1 000—稀释倍数；

V—试样消化液的定容体积，单位mL；

m —试样重量，单位g。

2 结果与分析

2.1 钙含量测定不确定度分量的来源与分类

根据数学模型，引入不确定度的主要来源如下（表3和图2）:

表3 钙含量测定不确定度分量的来源与分类

图2 测定不确定度因果关系

（1）样品称量（m）产生的不确定度；

（2）试样消化液定容体积（V）产生的不确定度；

（3）钙标准曲线溶液质量浓度；

（4）重复测定试样的不确定度。

2.2 钙含量测定不确定度分量的量化

2.2.1 试样称样量（m）不确定度

使用万分之一天平（最大称样量220 g、感量0.1 mg）准确称量牛乳样品0.250 g，检定证书标明测量结果的扩展不确定度U=0.5 mg，k=2，样品称样量的标准不确定度u（m）：

2.2.2 消化液定容体积（V）的不确定度

该消化液定容体积主要受两个因素影响：校准和温度影响。

（1）微波消解后，消化液转移到100 mL容量瓶（A级），定容至刻度，依据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，100 mL容量瓶（A级）的检定证书上标明，测量结果扩展不确定度U为0.050 mL，k=2。因此该容量瓶引入的标准不确定度：

（2）使用时和校准时，温度不同对溶液和容量瓶体积影响引入的不确定度按矩形分布计算。水膨胀系数2.1×10-4/℃，玻璃容器膨胀系数9.75×10-6/℃，从证书看到，该玻璃容器校准时温度20 ℃，而本实验室温度变动为±4 ℃，容器瓶容积膨胀远小于液体体积膨胀，容量瓶膨胀可忽略不计。产生的体积变化为±（50×4×2.1×10-4）=±0.042 mL，采用矩形分布将温度变化分量转化为标准不确定度：

由上述两个分量合成可得试样消化液定容的标准不确定度：

试样消化液定容体积（V）的相对标准不确定度：

2.2.3 标准曲线溶液的不确定度

（1）钙标准物质溶液引入的不确定度

本试验所用钙单元素溶液标准物质（1 000 μg/mL），由中国计量科学研究院提供，GBW（E）080118国家标准物质证书（批次号：23012）注明其相对扩展不确定度U为5 μg/mL（k=2），钙标准物质溶液浓度引入的相对标准不确定度：

（2） 钙溶液标准储备液及工作曲线溶液稀释配制过程中移液器引入的不确定度

A：5 mL单道移液器的检定证书标明，该移液器容量相对误差测量结果扩展不确定度为0.1%，U为5 μL（k=2），因此，5 mL可调移液器标准不确定度分量（表4）：

表4 5 mL 移液器引入的相对标准不确定度分量

5 mL可调移液器相对标准不确定度：

B：1 mL单道移液器的检定证书标明，该移液器容量相对误差测量结果扩展不确定度为0.15%，U为1.5 μL（k=2），因此，1 mL可调移液器标准不确定度分量（表4）：

1 mL可调移液器相对标准不确定度：

C：配制钙标准储备液需要移取2.5 mL钙单元素标准物质溶液；配制钙标准工作溶液分别移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL钙标准储备液。根据公式（13），可得单道可调移液器分别移取1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL液体体积的相对标准不确定度（表4）。

（3）钙标准储备液和钙标准工作曲线定容引入的不确定度

A：由于钙标准储备液、钙标准工作溶液的配制都用同批次的50 mL容量瓶（A级），其检定证书标明，测量结果扩展不确定度U为0.030 mL，k=2。该容量瓶引入的标准不确定度：

B：使用时和校准时温度不同对溶液和容量瓶体积影响引入的不确定度，按矩形分布计算，水产生的体积变化为±0.042 mL，采用矩形分布将温度变化分量转化为标准不确定度：

上述两个分量合成可得50 mL容量瓶定容后的标准不确定度：

50 mL容量瓶定容后的相对标准不确定度：

（4）钙标准储备液配制引入的不确定度

使用5 mL的单道移液器准确移取2.5 mL钙单元素溶液标准物质（1 000 μg/mL）于50 mL容量瓶（A级）中，用一级水定容至刻度。配制浓度50 μg/mL的钙标准储备液。则钙标准储备液的相对标准不确定度：

（5）钙标准工作曲线溶液配制引入的不确定度

分别使用1 m L 和5 m L 单道移液器准确移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL浓度50 μg/mL的钙标准储备液于5 个50 mL容量瓶（A级），加入2 mL氧化镧（50 g/L）溶液，用一级水定容至刻度。配制浓度1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL和5.0 μg/mL的钙标准工作曲线溶液。由于配制钙标准工作曲线溶液使用5 次钙标准储备液，钙标准工作曲线溶液配制引入的相对标准不确定度：

2.2.4 标准工作曲线拟合引入的不确定度

标准工作曲线共6 个浓度点，每个浓度点分别用原子吸收光谱仪检测1 次，得到相应吸光度A，以浓度为横坐标x，纵坐标y为对应吸光度，拟合后得曲线方程y=0.037 8x+0.001，相关系数r2=0.999 8，将标准工资曲线各浓度值c带入方程后结果见表5

根据公式再把表5里各个点的数值代入以下公式：

式中： u——拟合曲线的不确定度；

p——试样的测量次数，p=1；

n——标准工作曲线浓度的个数，n=6；

x——标准工作曲线实际检测出的平均浓度，c0=2.500 2 μg/mL；

xi——标准工作曲线各个浓度点实际检测出的浓度，μg/mL；

a——曲线的斜率，=0.037 8；

SR——回归曲线的剩余标准差（残差的标准差）；

y——标准工作曲线各个浓度实际检测出的吸光度；

yi——根据拟合曲线公式算出标准工作曲线各个浓度的吸光度。

标准工作曲线拟合带来的相对标准不确定度：

钙标准工作曲线溶液质量浓度的相对标准不确定度：

2.2.5 试样的重复性测定（Rep）引入的不确定度

在同样条件下重复检测牛乳试样10 次，检测结果见表6。

表6 牛乳试样中钙含量重复性试验检测数据

重复性试验(Rep)引入的标准不确定度：

即重复性试验（Rep）引入的相对标准不确定度：

式中，n为牛乳试样测定的重复次数，为测定牛乳试样中钙含量的平均值。

2.3 钙含量测定合成相对标准不确定的分量

各不确定度分量值见表7。

表7 牛乳中钙含量的不确定度来源汇总

试样中钙含量的相对标准不确定度：

试样中钙含量的合成标准不确定度uc（试样）

2.4 钙含量的扩展不确定度

取置信概率P为95%时，k=2，则该牛乳中钙含量的扩展不确定度：

3 结果报告

取95%置信概率P，k=2，该牛乳样品中钙含量的测定结果可表示X= +U=（123.8±3.22）mg/100 g。

4 结论

从不确定度的评定过程可看出，钙标准工作曲线溶液质量浓度引入的相对标准不确定度较大，其次是重复性测定引入的不确定度，试样称量与溶液定容体积引入的不确定度较小。钙标准工作曲线溶液质量浓度引入的相对标准不确定度较大的主要因素：钙标准储备液的配制、标准工作曲线溶液的配制和其拟合引入的不确定度。因此，配制储备液时尽量减少稀释次数，配制钙标准工作曲线溶液的浓度点不宜过多，对检测仪器和移液器定期校准、维护保养，保持性能良好。