罗望子种子中木葡聚糖的提取工艺优化

孙 婷，刘桂亭，林莎莎，邹圣灿，王宝群

（青岛琛蓝海洋生物工程有限公司，山东青岛 266104）

罗望子（Tamarindus indica L.） 是苏木科（Cae salpiniaceae） 酸豆属（Tamarindus） 的常绿大型乔木[1]，主要产于印度、孟加拉国、缅甸等地，在我国云南、广西等地区也有种植[2-4]。罗望子种子中的多糖含量高达60%[5]，其中木葡聚糖（Xyloglucan，XG） 是罗望子种子中的主要成分之一。因XG 资源丰富、工业生产成本低，又具有稳定、增稠等性质，可被用于代替果胶、明胶等作为一种食品添加剂，广泛应用于各种饮品、食品中。除此之外，XG 还有着良好的流变特性[6-7]、凝胶性[8-12]、黏附性[13]、生物相容性[14]，以及药物缓释[15-20]、降血糖血脂[21-22]、调节胆汁代谢[23]、体内防粘连[24-25]等生物活性，使众多学者越来越关注其在生物医药、医用材料等领域的应用。

罗望子种子中虽含有大量木葡聚糖，但其仍含有蛋白质（15.0%～20.0%）[26]、脂肪（3.0%～7.5%）[27]、纤维（2.5%～8.0%）[28]等杂质。蛋白质和脂肪是罗望子木葡聚糖提取过程中需重点去除的对象，相比之下，脂肪较易去除，而蛋白质则较为困难。罗望子种子中的蛋白质约有61%为可溶性蛋白，39%为不可溶性蛋白。同时，可溶性蛋白由约21%的盐溶性蛋白、19%的水溶性蛋白、17%的碱溶性蛋白及4%的醇溶性蛋白组成。因此，想要获得高纯度木葡聚糖的关键是在不引起多糖损失的前提下，高效去除罗望子种子中水溶性蛋白质。目前，对于罗望子木葡聚糖的提取纯化方法有2 种，分别是经典的水提醇沉法和有机酸提取法。水提醇沉法主要是通过醇沉将大部分多糖提取出来，而有机酸提取法则是通过等电点沉降法去除蛋白质，2 种方法均可去除罗望子木葡聚糖中部分蛋白质。通过这2 种方法制备的多糖，有着溶解性差、纯度不高等缺点，极大地限制了罗望子木葡聚糖在生物医药和医用材料中的应用，尤其是对于植入体内应用的第三类医用材料，因为较高的蛋白质残留有导致免疫反应的风险，现亟需一种可以制备高纯度罗望子木葡聚糖的方法。采用酸、碱处理，结合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白质，并对工艺进行初步研究，为木葡聚糖的提取工艺提供新思路，为其在生物医药、医用材料、食品、造纸、纺织等领域的应用提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

罗望子，云南猫哆哩集团提供；醋酸（分析纯）、考马斯亮蓝G-250、85%磷酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；活性炭，福建元力活性炭股份有限公司提供；透析袋（50 kDa），湖南羽博生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司提供；鲎试剂（0.1 mL/支）、细菌内毒素检测用水、内毒素标准品（10 EU /支），湛江博康海洋生物有限公司提供。

1.1.2 仪器与设备

SF-2000 型高速粉碎机，上海市药材有限公司产品；HH-1 型数显恒温水浴锅，常州丹瑞实验仪器设备有限公司产品；AR224CN 型电子天平，奥豪斯仪器（常州） 有限公司产品；JSB6-02 型电子计重秤，上海浦春计量仪器有限公司产品；DZ267-32C10 型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；Master-E plus UF 型纯水机，上海和泰仪器有限公司产品；LYO-100FS 型冷冻干燥机，北京开元永盛冻干技术有限公司产品；T6 型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；雷磁PHS-3E型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；Alpha 型傅里叶变换红外光谱仪，美国Bruker 公司产品；AVANCE III HD 400 MHz 型核磁共振谱仪，美国Bruker 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 罗望子木葡聚糖的提取工艺流程

将罗望子种子经过烘炒、粉碎、过筛、脱脂处理得到罗望子多糖粗粉；精确称取一定量的罗望子多糖粗粉，在高温下，按一定比例用水溶解，将溶液离心取上清液，得到罗望子多糖水提液；向水提液中加入醋酸，调节pH 值至2.5～4.5，静置沉降；再取上清液加入氢氧化钠，调节pH 值至10.5～12.5，静置沉降；取上清液加入活性炭吸附，离心后将上清液装入50 kDa 透析袋中透析；将透析后的溶液经过冷冻干燥得到罗望子木葡聚糖。

1.2.2 单因素试验

（1） 料液比对罗望子木葡聚糖纯度的影响。分别选取料液比为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，酸处理pH 值为3，碱处理pH 值为12，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定样品蛋白质残留量。

（2） 酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响。分别选取酸处理pH 值为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，料液比为1∶1，碱处理pH 值为12，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定样品蛋白质残留量。

（3） 碱处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响。分别选取碱处理pH 值为10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，料液比1∶1，酸处理pH 值为3，在其他步骤不变的条件下进行提取，测定样品蛋白质残留量。

1.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，设计正交试验。

L9（34）正交试验因素与水平设计见表1。

表1 L9（34）正交试验因素与水平设计

1.2.4 多糖含量检测

依据“苯酚- 硫酸法”测定样品中多糖含量。

1.2.5 蛋白质残留量检测

依据《中华人民共和国药典》 （2020 版） 四部通则0731 蛋白质含量测定法中第五法“考马斯亮蓝法（Bradford 法）”测定样品中蛋白质残留量。

1.2.6 细胞内毒素检测

依据《中华人民共和国药典》 （2020 版） 四部通则1143 细菌内毒素检查法中方法2“光度检测法”测定样品中细菌内毒素含量。

1.2.7 紫外吸收光谱

将所得木葡聚糖配制成质量浓度4 mg/mL 的水溶液，待充分溶解后进行紫外光谱扫描，波长范围为200～400 nm。

1.2.8 红外吸收光谱

将所得木葡聚糖与溴化钾按比例（1∶100） 混匀、研磨、压片后进行红外光谱扫描，扫描的范围为4 000～500 cm-1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对罗望子木葡聚糖纯度的影响

分别选取料液比为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（g∶mL），对罗望子木葡聚糖纯度的影响。

料液比对罗望子木葡聚糖纯度的影响见图1。

图1 料液比对罗望子木葡聚糖纯度的影响

由图1 可知，料液比对罗望子木葡聚糖蛋白质含量的影响并不显著，当料液比为1∶2 时，蛋白质含量最低，为1.25%。因此，选择1∶2 为最佳料液比。

2.1.2 酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响

分别选取酸处理pH 值为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，对罗望子木葡聚糖纯度的影响。

酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响见图2。

图2 酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响

罗望子粗粉中含有大量水溶性蛋白质，通过调节pH 值至蛋白质的等电点（Protein isoelectric point，PI），使蛋白质溶解性变小，形成容易去除的沉淀物。由图2 可知，酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖蛋白质含量的影响较大，随着pH 值升高，蛋白质含量先降低后升高，在pH 值为3.5 时蛋白质含量最低，说明大部分带负电荷的蛋白质被去除。因此，选择pH 值3.5 为最佳酸处理pH 值。

2.1.3 碱处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响

分别选取碱处理pH 值为10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，对罗望子木葡聚糖纯度的影响。

碱处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响见图3。

图3 碱处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响

由图3 可知，碱处理pH 值对罗望子木葡聚糖蛋白质含量的影响较大，随着pH 值升高，蛋白质含量先降低后升高，在pH 值为12 时达到最低值，说明大部分带正电荷的蛋白质被去除。因此，选择pH 值12 为最佳碱处理pH 值。

2.2 罗望子木葡聚糖纯度正交试验结果

为优化罗望子木葡聚糖的提取工艺，选取对提取工艺影响最大的3 个因素，每个因素设置3 个水平：料液比（1∶1，1∶2，1∶3）、酸处理pH 值（3.0，3.5，4.0）、碱处理pH 值（11.5，12.0，12.5）进行L9（34）正交试验。

L9（34）正交试验结果与分析见表2。

表2 L9（34）正交试验结果与分析

由表2 可知，罗望子木葡聚糖最佳提取工艺为料液比1∶3，酸处理pH 值3.5，碱处理pH 值12.0。通过计算极差可知酸处理pH 值对罗望子木葡聚糖纯度的影响最大，其次为碱处理pH 值，而料液比的影响最小。

2.3 验证性试验

罗望子木葡聚糖最佳提取工艺正交试验中，因此需在该条件下再进行验证试验：将罗望子多糖粗粉按料液比为1∶3 进行溶解，待样品溶解后将溶液离心取上清液，得到“罗望子多糖水提液”；向水提液中加入醋酸，调节pH 值至3.5，静置沉降；再取上清液加入氢氧化钠，调节pH 值至12.0，静置沉降；随后，取上清液加入活性炭吸附，离心后将上清液装入50 kDa 透析袋中透析；最后，将透析后的溶液经过冷冻干燥得到“精制罗望子木葡聚糖”。

2.3.1 理化指标检测

经检测精制罗望子木葡聚糖的蛋白质含量为0.2%，细菌内毒素含量为150 EU/g，总糖含量为99.63%。

2.3.2 紫外吸收光谱检测

罗望子木葡聚糖的紫外吸收光谱见图4。

图4 罗望子木葡聚糖的紫外吸收光谱

由图4 可知，罗望子多糖水提液于波长260 nm处无吸收峰，但在波长280 nm 处有较大吸收峰，证明该溶液含有大量蛋白质。精制罗望子木葡聚糖于波长260 nm 和280 nm 处均无吸收峰，表示样品中不含有蛋白质和核酸，或含量很少，与正交试验结果相同。

2.3.3 红外吸收光谱检测

罗望子木葡聚糖的红外吸收光谱见图5。

图5 罗望子木葡聚糖的红外吸收光谱

由图5 可知。表3 列举了部分峰的具体峰位置。2 个样品在3 600～3 200 cm-1处有O-H 伸缩振动的吸收峰，在3 000～2 800 cm-1处有C-H 伸缩振动的吸收峰，以上2 个峰为糖类物质的特征吸收峰。同时，2 个样品在1 380～1 370，1 040～1 030，940，890 cm-1处均有木葡聚糖的特征峰，其中1 380～1 370 cm-1为木葡聚糖中CH2弯曲振动[29]，1 040～1 030 cm-1为木葡聚糖中的C-O-C 伸缩振动，940 cm-1为葡萄糖的环振动，890 cm-1为葡萄糖和木糖β 端基的链接。说明2 个样品中均含有木葡聚糖。此外，罗望子多糖水提液在1 530 cm-1处有N-H 弯曲振动吸收峰，在1 250 cm-1处有C-N 伸缩振动峰，这2 个峰为蛋白质或多肽的特征吸收峰，而在精制罗望子木葡聚糖中不存在这2 个峰，说明经最佳提取方案制备的精制罗望子木葡聚糖其纯度大幅度提高，而蛋白质含量较低，与正交试验、紫外吸收光谱结果相似。

表3 罗望子木葡聚糖的红外测试结果/ cm-1

罗望子木葡聚糖的红外测试结果见表3。

3 结论

以罗望子种子为原料，利用罗望子木葡聚糖耐热、耐酸碱的特性，采用酸、碱处理，结合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白质，优化了罗望子木葡聚糖的提取工艺。在单因素试验的基础上，通过正交试验分析料液比、酸处理pH 值、碱处理pH 值3 种因素对木葡聚糖纯度的影响。试验结果表明，该提取工艺的最佳条件为料液比1∶3，酸处理的pH 值3.5，碱处理的pH 值12.0；各因素对木葡聚糖纯度影响的大小顺序为酸处理pH 值＞碱处理pH 值＞料液比。经验证，在最佳条件下，罗望子木葡聚糖的细菌内毒素含量为150 EU/g，总糖含量为99.63%，其蛋白质含量大幅度降低，含量为0.2%，与红外吸收光谱和紫外吸收光谱结果相类似。通过此工艺提取的木葡聚糖纯度较高，为木葡聚糖的提取工艺提供了新思路，也对其在生物医药、医用材料、食品、造纸、纺织等领域的应用作出贡献。