山药中黏液蛋白的提取与相对分子质量的探究

王海娟，石荣花，李艳红

（1.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；2.莱阳市检验检测中心，山东莱阳 265299）

黏液蛋白是存在于某些植物与动物体中的高分子量蛋白质，其组成和结构比较复杂，常与多糖组成蛋白－多糖复合体，被人体吸收后可转化为免疫蛋白[1]。铁棍山药是山药中的极品，其块茎富含黏液蛋白。国内外关于山药营养价值的研究较多，但对山药黏液蛋白的研究不多。以铁棍山药为研究材料，采用水提醇沉法提取山药黏液蛋白；采用SDSPAGE 法测定山药中黏液蛋白的相对分子质量，以期为山药黏液蛋白的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁棍山药粉（过80 目筛）。

1.2 试验试剂及设备

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、SDS、溴酚蓝、巯基乙醇、甘油、丙烯酰胺、次甲基双丙烯酰胺、盐酸、Tris-HCI、TEMED、过硫酸铵、R-250 考马斯亮蓝、甲醇、95%乙醇、异丙醇、冰醋酸、标准蛋白，除标准蛋白外其他均为分析纯。

TDZS-WS 型多管架自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；电子调温万用电炉，龙口市电炉制造厂产品；电子天平，梅特勒- 托利多仪器有限公司产品；数显恒温水浴锅，常州市万合仪器制造有限公司产品；TS-2 型双稳定时电泳仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 水提醇沉法试验过程

取样品1 g 于小烧杯中，加入去离子水25 mL，水浴锅内浸提2 h，以转速4 000 r/min 离心15 min，收集上清液，加入沉淀剂，搅拌30 min，静置过夜，以转速4 000 r/min 离心15 min，收集沉淀，烘干，得到黏液蛋白[2]。

1.3.2 单因素试验与正交试验设计

在浸提温度为42 ℃，料液比（黏液蛋白提取液体积∶沉淀剂体积） 为1∶4 的条件下，分别以甲醇、95%乙醇、异丙醇作为沉淀剂进行黏液蛋白提取，考查沉淀剂的种类对黏液蛋白得率的影响。在沉淀剂为异丙醇，浸提温度为42 ℃的条件下，选择料液比分别为1∶2，1∶3，1∶4 进行单因素试验，考查不同料液比对黏液蛋白提取率的影响。在沉淀剂为异丙醇，料液比为1∶4 的条件下，选择浸提温度为42，45，48 ℃进行单因素试验，考查不同浸提温度对山药黏液蛋白提取率的影响。根据正交试验，确定最合适的3 个试验条件。每组试验重复3 次。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.3.3 SDS- PAGE 法测定山药黏液蛋白的相对分子质量

浓缩胶体积分数为10%，分离胶体积分数为3%[3]。通过已知蛋白质的分子质量常用对数与相对迁移率（Rf） 绘制出标准曲线，未知蛋白质的分子则可由标准曲线上查出。Rf=蛋白质的迁移距离/示踪染料距离。蛋白质的迁移距离是指从分离胶的起始位点到蛋白质条带的前沿[4-5]。

2 结果与分析

2.1 沉淀剂种类对山药中黏液蛋白得率的影响

料液比为1∶4，浸提温度为42 ℃，沉淀剂采用甲醇、95%乙醇、异丙醇分别进行提取。

沉淀剂种类对山药中黏液蛋白得率的影响见图1。

图1 沉淀剂种类对山药中黏液蛋白得率的影响

由图1 可知，甲醇对山药中黏液蛋白的提取率几乎为零，95%乙醇的提取能力次之，异丙醇的提取能力最强。因此，选择异丙醇为沉淀剂。

2.2 料液比对山药中黏液蛋白得率的影响

沉淀剂采用异丙醇，浸提温度为42 ℃，料液比采用3 个水平，分别为1∶2，1∶3，1∶4。

料液比对山药黏液蛋白得率的影响见图2。

图2 料液比对山药黏液蛋白得率的影响

由图2 可知，料液比和山药中黏液蛋白得率呈正相关，料液比越大，山药中黏液蛋白得率越高。由此可见，最佳料液比为1∶4。

2.3 浸提温度对山药中黏液蛋白得率的影响

沉淀剂采用异丙醇，料液比为1∶4，浸提温度分别采用42，45，48 ℃。

浸提温度对山药中黏液蛋白得率的影响见图3。

图3 浸提温度对山药中黏液蛋白得率的影响

随着温度的提高，山药中黏液蛋白得率明显下降。42 ℃和45 ℃下浸提出的山药中黏液蛋白得率相差不大，而48 ℃下，山药黏液蛋白得率下降非常明显。因此，山药的最佳浸提温度为42 ℃。

2.4 正交试验结果

以沉淀剂种类、料液比和浸提温度为因素进行L9（34）正交试验。

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2 可知，对山药黏液蛋白得率造成影响的因素从大到小依次为（沉淀剂种类（A） ＞料液比（B） ＞浸提温度（C），最佳组合为A3B2C2。因A3B2C2组合在正交设计表中未出现，因此需进行验证试验。

验证性试验结果见表3。

表3 验证性试验结果

由表3 可知，A3B2C2组合的黏液蛋白得率为3.00%，高于其他组合，因此确定山药黏液蛋白的最佳提取条件为沉淀剂为异丙醇，料液比为1∶3，浸提温度为45 ℃。

2.5 山药黏液蛋白相对分子质量的测定

SDS-PAGE 电泳图见图4，标准蛋白标准曲线图见图5。

图4 SDS-PAGE 电泳图

图5 标准蛋白标准曲线图

样品2 为山药黏液蛋白。由图4 可知，用β - 巯基乙醇处理后的山药的黏液蛋白分离出2 条条带，分子量小的命名A 带，分子量大的命名为B 带。由图4 可知，A 带的Rf值为0.91。B 带的Rf值为0.53。根据图5，推算出A 带的相对分子质量为13.11 kD，B 带的相对分子质量为36.00 kD。

3 结论

铁棍山药黏液蛋白的最佳提取工艺如下：最合适的沉淀剂为异丙醇，最佳浸提温度为42 ℃，最佳料液比为1∶4。采用SDS-PAGE 法分离出的山药黏液蛋白中的A 带的相对分子质量为13.11 kD，B 带的相对分子质量为36.00 kD。根据SDS-PAGE 的结果，无法确定铁棍山药中的黏液蛋白为单一蛋白还是多种蛋白，所以仍需进一步研究确定。

对山药黏液蛋白提取工艺优化后，黏液蛋白提取率可达3%，与其他试验的提取工艺相比，山药黏液蛋白提取率增加了1%，黏液蛋白的提取率明显提高[5]。水提醇沉法的缺点是容易残留有机溶剂，存在着一定的安全风险，多用于试验[6]。若用于生产，还需对残留的有机溶剂进行去除。