鸡坏死性肠炎病原菌的分离与鉴定

陈 成，孙思楠

（六安市裕安区农业农村局 237010）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是革兰阳性粗大杆菌，属厌氧菌，但对厌氧的要求不高，广泛存在于自然界的水源、土壤、尘埃中。产气荚膜梭菌在不同动物的身上都有致病性，可引起人及动物的创伤性坏疽[1－3]，导致了较为严重的食品安全问题。各型产气荚膜梭菌均含有α 毒素 （CPa）基因，α 毒素被认为是最基本、最重要的致病因子[4]。本文对淮南市某肉鸡养殖户送检的疑似坏死性肠炎的病死鸡进行了病原菌的分离与鉴定，并对其进行了药敏试验，生化试验，动物接种试验等来确定其相关的特性。在六安的周边地区，许多养殖户所养的鸡都因为坏死性肠炎而有所亏损。由于鸡坏死性肠炎发病的广泛性和难以防治，给养殖户带来大量的经济损失。坏死性肠炎被认为是影响肉鸡行业的全球疾病之一，坏死性肠炎不但影响鸡的生产性能而且易引发一些其他的疾病，造成严重的损失。此外由于许多养殖人员和兽医工作人员对此病的认识不足，重视不够也会造成许多不必要的损失。由此，对鸡坏死性肠炎的研究，进行分离和鉴定，对于指导鸡坏死性肠炎的预防和治疗有重大意义，也丰富了鸡坏死性肠炎的流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

健康家兔一只，昆明小鼠四只。

1.1.2 病料

一只病死鸡的肝和肠道。

1.1.3 培养基

厌氧肉肝汤、生化试验培养基、糖发酵培养基、分离培养基、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶（SPS）琼脂培养基。

1.1.4 药敏纸片

卡纳霉素，头孢噻吩，麦迪霉素，头孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，头孢他啶，复方新诺明，头孢吡肟，米诺环素，诺氟沙星，克拉霉素，环丙沙星，氧氟沙星，头孢噻肟，庆大霉素，头孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素。

1.1.5 主要仪器及试剂

DK-8D 电热恒温水槽（上海医用恒温设备厂），高速离心机（德国Eppendorf 公司），LDZX-SOFBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），培养箱（力康生物医疗科技股份有限公司），天平（上海医用激光仪器厂），培养皿，试管，量筒，三角烧瓶，玻璃棒，超净工作台（上海三发科学仪器有限公司），pH 试纸，电磁炉，试管塞，包装纸扎绳，酒精灯，接种环，各种类型针头，搪瓷缸。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备

1.2.1.1 厌氧肉肝汤的制备

肉肝浸液1000 mL；蛋白胨10 g；氯化钠5 g；葡萄糖2 g；pH 调至7.6～7.8。

首先，取去筋膜及脂肪的牛肉和去筋膜的肝250 g，将其切成小块，加入1000 mL 水，搅拌均匀，冷浸20～24 h。然后取出，加热煮沸20～60 min，注意不要沸腾时溢出。补足水量，用纱布过滤，弃去肉渣及肝块。然后，在肉肝汤中加入蛋白胨，氯化钠，加热溶解，调节pH值。煮沸10～20 min，冷却后加入已经混匀的肉肝汤浸液，加入葡萄糖混匀。将煮过的肝块，用水冲洗后切成宽0.5 cm 以下的小方块，用水冲洗后分装试管，加入已经混匀的肉肝汤，比例为1∶10。最后再加盖3～4 mm 厚的液体石蜡，116℃，30～40 min。

1.2.1.2 sps 培养基的制备

胰蛋白胨15 g，酵母浸膏10 g，柠檬酸铁0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH=7.2

加热煮沸1～2 min，溶解。将溶解后的溶液迅速放入高压灭菌锅中121℃高压维持15 min。每升中加入下列过滤除菌溶液：100 g/L NaSO37H2O 5 mL；1.2 g/L 多粘菌素B 硫酸盐溶液10 mL；1.2 g/L 磺胺嘧啶钠溶液10 mL。

1.2.2 细菌增菌培养

从病死鸡的肠道中用无菌接种环刮取病变组织，穿刺接种到已经分装好的厌氧肉肝汤中，点燃酒精灯，灼烧接种针灭菌。左手执试管，右手执接种环，从病变组织中挑取少许病变组织，刺入肉肝汤内，深度接近试管底部，但不可过深。接种后抽出接种针，将试管塞和试管口迅速在火焰上灼烧杀菌后，将试管塞塞回试管口。再将多余在接种针的细菌在火焰上烧毁。接种完毕后，在试管上做好菌名、日期等标记，放在恒温培养箱中恒温培养24 h。24 h 后肉眼可见肉肝汤变得少许浑浊。用离心机高速离心，3500 r/min 离心10 min，可在试管底部看见白色沉淀物。涂片革兰氏染色后油镜下观察到大量短柱状菌体。

1.2.3 细菌的分离培养

首先将sps 培养基倾倒分装到培养基内。然后将肉肝汤中的菌体接种到该分离培养基中，点燃酒精灯，灼烧接种环，灭菌。左手执培养皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精灯的地方将培养皿打开约20o左右，右手执接种环，从肉肝汤中刮取少量液体，用划线法在培养基中划线接种。接种结束后，迅速盖好培养皿。在其背面标注好菌名、日期标记。整个操作过程中注意无菌操作。完成后，将培养基放在37℃的恒温培养基中，隔夜培养。培养后观察细菌形态，革兰氏染色，镜检，用厌氧肉肝汤对单个菌落进行纯培养。培养后采取革兰氏染色，镜检细菌形态、染色特征。

1.2.4 生化试验

将获得的细菌纯培养产物，分别接种在麦芽糖培养基、葡萄糖培养基，乳糖培养基、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水上，培养后观察各个培养基的试验现象。

1.2.5 动物接种试验

试验动物分别为小鼠和家兔。首先采用腹腔注射的方法，将在分离培养中获得的细菌纯培养产物注射到小鼠体内。正常饲喂24 h 后，制作心脏的血涂片。在载玻片上滴加一滴清水，破开小鼠腹部，取出心脏，用灼烧后的手术刀切入小鼠心脏，然后采用无菌操作的方法，点燃酒精灯，灼烧接种环，灭菌。左手执培养皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精灯的地方将培养皿打开约20o左右，右手执接种环，从小鼠心脏的开口处刮取少量血液，将血液在载玻片清水上均匀涂开，待其正常干燥后待作镜检。同时也制作健康小鼠的心脏血液涂片作对比观察。

在对家兔的实验中，采用静脉注射的方法将细菌纯培养物注入到家兔体内。立即处死，将尸体在恒温箱内保存24 h。同上述一样的方法，取出兔子肝脏，观察肝脏病理变化，并制作肝触片，同时也做一组空白对照，取一只健康家兔的肝脏制作触片进行对比观察。

1.2.6 药敏试验

将细菌纯培养产物加少许培养基中进行药敏试验。用到的药物有：卡那霉素，头孢噻吩，麦迪霉素，头孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，头孢他啶，复方新诺明，头孢吡肟，米诺环素，诺氟沙星，庆大霉素，环丙沙星，氧氟沙星，头孢噻肟，头孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素等。

2 试验结果

2.1 增菌培养结果

将离心后的增菌液底部菌体，挑取少许在油镜下观察，看到较多的是一些短大，呈椭圆形，两端钝圆的杆菌，为革兰氏阳性菌。

2.2 分离培养结果

首先在sps 培养基上看到了许多黑色圆形菌落生长。挑取黑色菌落做成涂片在油镜下观察，涂片中的细菌大小形态一致，可判断为同一菌体。菌体呈革兰氏阳性，两端钝圆，椭圆形短大有荚膜的杆菌。查阅相关资料推测该菌为产气荚膜梭菌[1]。

2.3 生化试验结果

表1 糖发酵试验结果

表2 其他生化试验结果

从糖酵解表中可以看出该菌对葡萄糖，麦芽糖，乳糖的酵解均有产酸产气现象。而该菌的甲基红试验和吲哚试验均显示为阴性，vp 试验和枸橼酸盐试验的结果均显示为阳性。这些现象均符合产气荚膜梭菌的生化试验特征。

2.4 动物接种试验结果

2.4.1 接种家兔的试验结果

在家兔的肝脏表面和内部均发现了大量因为气泡而产生的气孔，该病理变化符合产气荚膜梭菌的病理变化特征。对接种的家兔肝脏进行触片，革兰氏染色观察，在油镜下可清楚的看到肝脏有大量的短粗，两头钝圆的革兰氏阳性菌落。这也符合产气荚膜梭菌的细菌形态学。

2.4.2 接种小鼠的试验结果

接种小鼠在24 h 内全部死亡。对死亡后的小鼠心脏做心血涂片，革兰氏染色。在油镜下也可清楚的看到短粗，两头钝圆的椭圆形革兰氏阳性菌体。

2.5 药敏试验结果

从表中可以看出，头孢他啶对该菌的抑制最为明显。其次哌拉西林、米诺环素、头孢噻肟、妥布霉素、头孢哌酮、氯霉素、克林霉素对其抑制也较为明显。其中麦迪霉素、复方新诺明、头孢吡肟、环丙沙星对其影响较小。

表3 药敏试验结果

3 讨论与小结

试验分离鉴定了病死鸡的肝和肠道细菌，经生化试验、动物接种试验、药敏试验，可确定该病原菌为产气荚膜梭菌。首先sps 培养基生长出了黑色菌落，据相关资料表明[5-6]，产气荚膜梭菌在sps 培养基生长出的菌落即为黑色菌落。其次在显微镜下观察到的细菌形态也符合产气荚膜梭菌的细菌形态学。我们同时对该菌进行了生化检测，检测结果表明，该菌的生化性质和产气肠杆菌的生化性质相似。在动物接种试验中，腹腔接种小白鼠24 h 内全部死亡，在其心血涂片中发现了该菌的存在，证明该菌具有较强的致病性。接种的家兔在其肝脏发现了产气荚膜梭菌所产生的特征性病变。由以上四点可以推测出引起鸡坏死性肠炎的病原菌为产气荚膜梭菌。药敏试验结果表明，头孢他啶对该菌的抑制最为明显。其次哌拉西林、米诺环素、头孢噻肟、妥布霉素、头孢哌酮、氯霉素、克林霉素对其抑制也较为明显。其中麦迪霉素、复方新诺明、头孢吡肟、环丙沙星对其影响较小。