基于层次分析法及多指标正交试验优选消疳健胃合剂水提工艺

张乐怡,张晓芹,王慧玉,雷后兴

(浙江中医药大学附属丽水市中医院药剂科·浙江 丽水 323000)

小儿疳证是指由于喂养不当或罹患他病导致小儿脾胃受损,运化失健,气液耗伤,肌肤筋骨经脉脏腑失养而形成的一种慢性消耗性疾病,是儿科的四大病症之一[1-3]。随着国内对民族医药的关注与深入研究,近年来,畲医药在小儿疳证等多种疾病的治疗中取得了良好的进展[4-8]。消疳健胃方为畲族民间验方,经畲医的民间应用和本院前期临床应用表明,该方具有消食化积、健脾和胃的功效,对小儿疳症、食积、食欲改善等病症具有较好的临床治疗效果[2]。消疳健胃方由食凉茶、陈皮、山楂、茯苓、麦芽、稻芽、鸡内金组成。其中食凉茶为畲族特有药材,在民间畲族常用其治疗伤食所致的痞满证和慢性胃炎,在临床上对于风热表证、脾虚食滞、胃脘痛、泄泻、吞酸等病症均具有较好的治疗效果[9-11],为方中君药。陈皮具有理气健脾功效,常用于脘腹胀满,为方中臣药。研究表明,山柰酚-3-O-芸香糖苷为君药食凉茶的主要化学成分,具有抗氧化、抑制脂肪合成、减轻急性肝损伤等作用,常作为食凉茶质量特征的表征成分[12-15];橙皮苷、川陈皮素为陈皮主要活性成分,具有兴奋胃肠道、促进胃排空、抑制肠上皮细胞炎性损伤、改善代谢紊乱、抗病毒等作用,常作为陈皮质量特征的表征成分[16-20]。本文在文献考证的基础上,选择君药和臣药的主要化学成分进行制剂的整体质量考察。

该方原剂型为汤剂,煎煮不当容易影响后续药效,且不易保存、携带不便。因此本研究参考消疳健胃汤的组方特点和临床应用形式,考察该方剂的水提取工艺,结合层次分析法进行正交设计试验,优选消疳健胃合剂最佳提取工艺,为该制剂的制备提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪,配置Empower 3 Personal Single System SW化学工作站：Waters公司,美国;Smart2Pure Pro型超纯水机：Thermo Electron LED GmbH公司,德国;十万分之一电子分析天平：上海良平仪器仪表有限公司;TC-15系列恒温电热套：海宁市华星仪器厂。

1.2 试药与试剂 橙皮苷(批号：110721-201818,纯度96.2%)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号：112007-201602,纯度90.8%)、川陈皮素(批号：112055-202001,纯度99.6%)标准品均由中国食品药品检定研究院提供。实验用的中药饮片均来源于本单位中药库,经本单位中药饮片验收小组验收,食凉茶符合2015年版《浙江省中药炮制规范》,其余均符合《中国药典》2020年版的相关规定;见表1。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂为分析纯。

表1 中药饮片信息

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters XTERRA C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL·min-1,进样量10 μL,柱温：30 ℃,检测波长230 nm;流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脱,(0～10 min,5%A→15%A;10～20 min,15%A→21%A;20～25 min,21%A→22%A;25～30 min,22A%→23%A;30～35 min,23%A→30%A;35～45 min,30%A→48%A;45～55 min,48%A→55%A;55～60 min,55%A→5%A);理论塔板数按山柰酚-3-O-芸香糖苷计算不低于3500。

2.1.2 混合对照品溶液制备 精密称取橙皮苷7.50 mg置于20 mL容量瓶中,山柰酚-3-O-芸香糖苷10.30 mg、川陈皮素10.80 mg,置于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即分别得对照品母液。分别精密量取一定量的对照品母液至10 mL容量瓶中,制成含橙皮苷23.45 mg·L-1、山柰酚-3-O-芸香糖苷51.44 mg·L-1、川陈皮素10.76 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取消疳健胃合剂水煎液1 mL,用甲醇定容至10 mL,用0.22 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照品溶液制备 按处方中比例称取各药材,分别制备缺食凉茶阴性对照样品,缺陈皮阴性对照样品,缺食凉茶、陈皮阴性对照样品,按“2.1.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样。结果表明,在供试品溶液色谱图中,在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相同色谱峰出现,峰形良好,且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 专属性检查色谱图(1.橙皮苷;2.山柰酚-3-O-芸香糖苷;3.川陈皮素)

2.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液,在“2.1.1”色谱条件下,分别进样1,3,5,10,15,20 μL,以峰面积为纵坐标(Y),各组分含量为横坐标(X),绘制标准曲线,结果见表2,可知在线性范围内,3个组分的峰面积与进样量线性关系良好。

表2 回归方程及线性范围

2.1.7 仪器精密度试验 精密量取10 μL混合对照品溶液,在“2.1.1”项色谱条件下,连续进样6 次,测得橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、川陈皮素的峰面积RSD分别为0.85%、0.95%、0.87%,表明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取同一批水煎液,按“2.1.3”项下方法,平行制备6份供试品溶液,在“2.1.1”项色谱条件下测定,测得橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、川陈皮素峰面积RSD分别为2.35%、2.57%、2.51%,表明此方法重复性良好。

2.1.9 溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液,在“2.1.1”项色谱条件下,于0,3,6,9,12,18 h分别进样,测得橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、川陈皮素峰面积RSD分别为2.38%、2.00%、2.00%,表明在18 h内,该溶液稳定。

2.1.10 加样回收率试验 精密吸取已知各组分含量的供试品溶液,共6 份,分别加入约等量成分的对照品溶液,按“2.1.3”项制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定,测定结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=6)

2.2 水提工艺试验

2.2.1 因素水平 查阅文献,选择浸泡时间(A)、加水量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)作为影响因素[21-25],因素水平见表4。

表4 因素水平表

2.2.2 层次分析法确定权重[26-28]根据复方中食凉茶为君药、陈皮为臣药的君臣佐使配伍关系及活性成分药理作用,选取橙皮苷(Y1)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(Y2)、川陈皮素(Y3)的含量(μg)和干膏得率(Y4)为权重指标给予量化,根据1～9 级标度法对4 项指标进行两两比较,按9 分位比率评判各评价指标相对重要顺序[24],确定各指标的先行顺序为：山柰酚-3-O-芸香糖苷>橙皮苷=川陈皮素>干膏率,指标判断优先矩阵见表5。根据和积法计算得各指标的权重系数分别为0.2272,0.4231,0.2272,0.1225,随机一致性比率CR=0.004<0.1,表明指标成对比较的判断矩阵满足一致性检验,权重系数有效。

表5 指标成对比较的判断优先矩阵

2.2.3 正交试验方法 按比例称取处方中各药材,共63 g,称取9 份,按正交实验表L9(34)安排的试验方案[29-31]进行全方水提,滤过,合并两次水提液,并将其浓缩至150 mL,每个正交试验号平行3 次试验。制备得到的样品溶液,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,分别测定正交供试品溶液中橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、川陈皮素的含量,分别取其平均值进行综合评分。

2.2.4 干膏得率测定 精密吸取9 种工艺条件下水煎液50 mL,水浴蒸干,置105 ℃烘箱中干燥至恒重,按下式计算干膏得率：

干膏得率(%)=(50 mL浓缩液中固形物质量/50 mL×定容体积mL)/生药材重量×100%

2.2.5 结果分析 实验结果采用综合评分法,根据层次分析法所得权重系数计算综合评分。综合评分=(Y1/Y1最大值)×0.2272+(Y2/Y2最大值)×0.4231+(Y3/Y3最大值)×0.2272+(Y4/Y4最大值)×0.1225。实验结果见表6,直观分析结果见表7,方差分析结果见表8。

表6 水提工艺正交试验结果

表7 直观分析结果

表8 方差分析

由表7直观分析可知,以橙皮苷、川陈皮素、干膏得率为指标,煎煮次数(D)为主要影响因素;以山柰酚-3-O-芸香糖苷为指标,各因素的作用为C>D>B>A,工艺组合为A1B2C1D2;对于综合评分,各因素作用为D>C>B>A,工艺组合为A1B2C2D2。分别以极值最小的因素为误差项进行方差分析,结果显示：对于橙皮苷和干膏得率,D因素有显著影响;对于川陈皮素,C、D因素均有显著性影响;对于山柰酚-3-O-芸香糖苷和综合评分,各因素均无显著影响。结合直观分析结果和生产成本考虑,最终选取A1B2C2D2条件为最佳水提工艺,即药材饮片不浸泡,加8 倍量水,煎煮2 次,每次2 h。

2.3 验证试验 按照处方比例称取3份药材63 g,按照确定的最佳提取工艺进行验证试验,测定结果见表9。

表9 验证试验结果

3 讨论

消疳健胃汤原为药材水煎剂,在临床上已取得较好疗效。消疳健胃合剂的制备选用水作为提取溶剂,能最大程度保留原方的煎药方式,降低物质基础发生变化的隐患[32]。

通过文献查阅、对照品比对以及阴性溶液专属性考察发现,山柰酚-3-O-芸香糖苷为方中食凉茶特有,橙皮苷、川陈皮素为陈皮所特有,专属性良好且含量相对较高。通过二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内扫描后发现在230 nm波长处3 个成分指标均有较大吸收,且基线稳定、分离度良好。因此选取230 nm作为试验检测波长。

传统中药复方组分复杂,作用机制不明确,仅采用单一成分作为评价指标缺乏全面性[33]。本文以方中君臣药的主要化学成分为测定指标,同时结合层次分析法建立判断矩阵可将各指标间的相互联系转为可量化的权重系数,使综合评价更具科学性。

水提是中药合剂的重要工艺单元,其加水倍数、提取时间和提取次数对处方有效成分的保留和制剂具有重要意义。针对橙皮苷、川陈皮素、干膏率指标而言,加水量为10 倍、提取次数为3 次评分效果最好,然而以山柰酚-3-O-芸香糖苷和综合评分指标而言,加水量为8 倍、提取次数为2 次效果最好,考虑到正交结果未发现显著性差异,且加水量、提取次数减少可以节约成本和效能,另外,在临床实际煎煮中,也是以煎煮2 次为最佳,因此最终选择加水量为8 倍、提取次数为2 次。

本文采用层次分析法结合多指标综合评价,对消疳健胃合剂的最佳水提工艺进行了考察,为消疳健胃合剂的进一步开发研究和临床应用提供了参考依据。