基于动脉粥样硬化家兔模型研究痹病药膳方代谢组学与配方优化

杨彩艳,方晓燕,卢国康,黎飚,黄永毅,李小婷,莫枫川,农成威,李保生,王金花,

(1. 广西壮族自治区中药体内药物化学数据库建设与应用工程研究中心,广西 百色 533000;2. 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室,广西 百色 533000;3. 广西高校生态铝工业基地环境与人群健康研究重点实验室,广西 百色 533000;4. 桂林医学院,广西 桂林 541001)

心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases,CCD)主要病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),全球仅由冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)导致的致死率约为31%[1-2]。在中医病名中没有发现AS 病名,但其症状和中风、胸痹、眩晕等相似,属于中医痹病的范畴。痹病的病因病机主要因火旺、血虚、痰浊、气滞、阴虚等导致,常采用清热解毒、活血化瘀、益气养血等治疗。

痹病药膳方由鸡血藤(Spatholobus suberectus Dunn)、土茯苓(Smilax glabra Roxb)和猪腿骨组成,在壮族地区被广泛用于防治瘫痪[3]。鸡血藤为豆科密花豆属密花豆的根、茎,因其具有养血活血、通经活络等功效而在中医临床中被用于治疗贫血病、月经病和动脉粥样硬化性心脑血管疾病等,现代药理学研究结果表明鸡血藤乙醇提取物具有抗炎、神经保护、降血脂、改善血液流变学、补血和抗癌等药效[4-8]。土茯苓属于百合科菝葜属土茯苓的根,具有解毒、除湿、通利关节药效,常用于治疗梅毒、重金属中毒、肌张力增高、肾炎、心血管疾病、糖尿病血管并发症等,现代药理学研究表明它具有抗炎、抗氧化和抗心衰等药效[9-12]。猪腿骨是一种食物并可用于提供营养从而增强人体的免疫力即中医理论中的“补气”。中药黄芪(Astragalus membranaceus Fisch)为豆科黄芪属植物膜荚黄芪的根,因其具有药效好、价格低在被广泛用于增强人体免疫力,现代药理学研究表明黄芪具有提高心功能、促进血管生成、调节血糖、抗癌、增强免疫调节活性等药效,其主要的药效成分为黄酮类、三萜皂苷类和多糖[13-17]。

痹病药膳方在壮族地区被用于防治类风湿性关节炎、动脉粥样硬化(AS)、痛风等痹病,但尚无其药效、作用机制、组方优化、配伍规律等研究的报道。本文比较研究各配方家兔血清代谢组学,比较研究最优配方血清、心和肝的代谢组学,优化其配方和研究其代谢机制,为深入研发痹病药膳方提供科学实验基础。

1 材料和方法

1.1试剂和动物 胆固醇(No.531F102,Solarbio),总胆固醇(TC)(No.201012;maccera biology Co.Lt-d.),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(No.200928;maccera biology Co.Ltd.),甘油三酯(TG)(No.201020;maccera biology Co.Ltd.),高密度脂蛋白(HDL-C)(No.200928;maccera biology Co.Ltd.),超氧化物歧化酶(SOD)(No.20010910228;Meikang biotechnology Co.Ltd),乌拉坦(氨基甲酸乙酯,HY1223-500g,上海恒远生物科技有限公司),家兔(No.0008757,雌雄各半,4.5个月龄,体重2.00～2.50 kg,广西田东兔业有限责任公司)。

1.2痹病药膳方的制备 痹病药膳方组成为25 g鸡血藤、25 g 土茯苓和500 g猪腿骨[3]。配方1为75 g鸡血藤,配方2为37.5 g鸡血藤和37.5 g土茯苓,配方3为34.5 g鸡血藤、34.5 g土茯苓和6 g黄芪;根据人-动物药物剂量换算表将其换算成家兔的剂量都是3.5 g/(kg·d),血脂康的剂量是 0.36 g/(kg·d)[18]。药材于2020年9月15日购自百色市正阳药店,样本(No.20200915) 存放于广西壮族自治区中药体内药物化学数据库建设与应用工程研究中心。血脂康胶囊(No.20201201)作为阳性药物,购自北京北大维信生物科技有限公司。分别依次使用乙醇-水(90∶10、50∶50和5∶95,每种溶剂提取3次,每次提取72 h) 在室温下浸提8 kg配方1、配方2和配方3的药材,提取液减压浓缩至 2 L。

1.3样本采集和药效评价 高脂饲料自制,成分为胆固醇-猪油-蛋黄粉-基础饲料(1∶8∶4∶87)[18]。48只家兔单笼饲养,适应1周后随机分为正常组(CG)、模型组(MG)、血脂康组(PG)、配方1组(SG)、配方2组(DG)和配方3组(AG),每组都是雌雄各半。 实验60 d,每周称1次体重,正常组给予基础饲料,其他组给予高脂饲料;此外,血脂康组、配方1组、配方2组和配方3组 分别口服给予血脂康、配方1～3,给药60 d。

实验结束后所有家兔禁食不禁水12 h,采集耳缘静脉血液,检测血浆 TC、LDL-C、TG、HDL-C和SOD含量(7600-020 全自动生化分析仪,Hitachi) 及测试血液流变学(SA9000 全自动锥板式血液流变分析仪)。所有家兔耳缘静脉注射乌拉坦-水(25∶100,m/v;4 mL/kg) ,然后从颈静脉收集血清、心和肝,用于代谢组学研究,采集主动脉弓样本,用Motic BA210数码生物显微镜和Motic BA600虚拟扫描切片系统分析病理切片分析。

1.4代谢组学分析 80 mg 心和肝样本依次加入 200 μL H2O,匀浆、涡旋60 s,加入800 μL甲醇-乙腈(1∶1,v/v)、涡旋60 s和低温超声30 min 2次。 400 μL甲醇-乙腈(1∶1,v/v) 加入到100 μL心和肝的样品及血清中,所有样品涡旋60 s,并在-20 ℃放置1 h沉淀蛋白质,然后在14 000 r/min离心10 min,上清液使用0.22 μm滤膜过滤,并使用 UPLC-Q-TOF-MS(Agilent 1290 超高效液相色谱、Agilent,AB Triple TOF 6600 质量分析器、AB SCIEX)分析,Q-TOF-MS 配置电喷雾(ESI) ,UPLC 配置色谱柱(填料:Waters、ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm,柱规格2.1 mm×100 mm;填料:Waters、ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,柱规格2.1 mm×100 mm)。色谱条件和质谱参数设置同参考文献[18]。代谢组学研究由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

2 结果

2.1痹病药膳方在AS家兔模型中的作用 实验期间所有家兔的体重都是稳定增加的,不同组间体重差异不明显。其它各组的 SOD值都比正常组低,30 d时差异无统计学意义,60 d时差异有统计学意义,其它各组间的差异无统计学意义,见表1。这表明因高脂诱导的氧化应激在30 d内不明显,当实验持续到60 d时导致家兔产生氧化应激障碍,配方1～3均没有表现出明显的抗氧化活性。

表1 家兔血液流变学和SOD数据 (n=8)

血清脂质数据结果,见表2。与正常组TG、TC、LDL-C和HDL-C相比,模型组值大且差异有统计学意义(P<0.01);血脂康组、配方1组、配方2组和配方3组的值高于正常组但低于模型组,与模型组之间的统计学差异显著; 在血脂康组、配方1组、 配方2组和配方3组中,除HDL-C值外,其它血脂值从高到低的顺序是 配方1组、配方2组、配方3组和血脂康组;配方3组血浆的 HDL-C 值要高于配方1组和配方2组但其它值却比它们更低。这些结果表明家兔高脂饮食能导致高血脂疾病,血脂康、配方1～配方3均表现一定程度的预防药效,药效由强到弱的顺序是:血脂康→配方3→配方2→配方1,使用少量黄芪代替同质量的鸡血藤和土茯苓能增强抗AS免疫能力,黄芪在配方3中扮演佐药和使药的角色。

表2 主动脉弓和血脂数据 (n=8)

血液流变学的数据见表1。和正常组相比,除血浆黏度和全血高切指数外,模型组各项值升高且差异有统计学意义。大部分配方2组和配方3组的值都高于正常组,但低于模型组的值,配方2组和模型组相比,只有全血高切指数、60 d时全血黏度、30 d时血浆黏度和60 d时全血低切指数的统计学差异无统计学意义。配方3组与配方2组之间,只有全血黏度、60 d时血浆黏度、30 d时全血高切指数差异有统计学意义,且配方3组的高于配方2组的。以上结果表明家兔高脂饮食可以诱导高黏血症,配方2和配方3都具有预防药效,配方2药效略优于配方3。

主动脉弓病理形态研究的结果见图1,内膜厚度值、内膜、中膜厚度比值及粥样斑块面积结果见表2。正常组内膜的内皮细胞相对完整和排列整齐,内部弹力膜清晰;中膜平滑肌中细胞的排列和体积都是正常的,从内膜到中膜都没有发现泡沫细胞和脂质沉积。和正常组相比,模型组内膜内皮细胞出现肿胀和变性,聚集有很多泡沫细胞,一些内弹力膜断裂;平滑肌受损和排列浑浊,从内膜到中膜都发现脂质在细胞外沉积。血脂康组、配方1组、配方2组和配方3组发生了和模型组相似的病变但程度比模型组轻,其病变程度由重到轻的顺序是配方1组、配方2组和配方3组、血脂康组且与内膜厚度值、内膜、中膜厚度比值及粥样斑块面积一致。这些结果表明血脂康的药效最强,配方1的药效最弱,配方2药效弱于配方3。综合抗氧化、降血脂、改善血液流变学和病理形态结果,配方3是抗AS的最优配方。

注:CG为正常组,MG为模型组,PG为血脂康组,SG为配方1组,DG为配方2组,AG为配方3组。图1 主动脉弓病理形态研究结果 (10×)

2.2代谢组学

2.2.1模型可靠性和稳定性研究 为了阐明痹病药膳方不同配方代谢轮廓差异,比较研究了各配方干预AS家兔血清代谢组学;为了更全面阐述痹病药膳方代谢轮廓,比较研究了配方3干预AS家兔血清、心和肝代谢组学。质控(QC) 样品UPLC-Q-TOF-MS总离子流图保留时间的重叠性和色谱峰的响应强度都很好,表明整个实验过程中仪器误差引起的变化较小。使用XCMS软件在正/负离子模式下分别从血清、心和肝中提取到的离子峰数目分别是11489/8516、16286/11321和16147/11150,正离子峰的数目均高于负离子峰,表明研究所有器官组织中正离子模式优于负离子模式。

使用UPLC-Q-TOF-MS数据建立主成分分析(PCA)模型识别正常组、模型组、配方1组、配方2组和配方3组 之间的总体差异(见图2、图3、表3)。所有 QC正负离子模式下的离子峰都紧密聚集,表明实验具有良好的重复性。得分图表明除了负离子模式下血清中的模型组和正常组、配方2组和模型组外,其它不同组间能很好的聚类。这个结果表明心、肝及正离子模式下血清中鉴别的代谢差异物都是可行的。此外,使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA) 和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)识别不同组间的代谢差异物(见图4～图6,表3)。除心在正离子模式下其配方3组和模型组的值为0.473 cum外,其它的都大于0.50 cum;表明代谢模型稳定可靠,心在正离子模式下其配方3组和模型组之间模型的稳定性也较好。

注:左图和右图分别在正负离子模式下测试,两种模式下R2X值分别是0.544和0.555;CT、MD、EJ、EY和EHY分别代表正常组、模型组、配方1组、配方2组和配方3组。图2 血清质量控制样本(QC)的主成分分析(PCA)得分图

注:上下图分别为正负离子模式。CG为正常组,MG为模型组。图4 血清中模型组(蓝色)和正常组(绿色)比较PCA(左图)、PLS-DA(中间)和OPLS-DA(右边)得分图

注:上下图分别为正负离子模式。CG为正常组,MG为模型组。图6 肝中模型组(蓝色)和正常组(绿色)比较PCA(左图)、PLS-DA(中间)和OPLS-DA(右边) 得分图

表3 多元统计分析R2X、R2Y和Q2值

2.2.2代谢差异物研究 正常组和模型组之间的差异代谢物(variable metabolites,VM,P<0.05)被定义为疾病代谢差异物(diseases metabolite,DM);既是疾病代谢差异物也是模型组和药物组间的代谢差异物,且配方对模型组的调控方向和模型组与正常组的相反,被定义为药效代谢差异物(pharmacodynamic metabolite,PM)。血清、心和肝中识别的DM如表4和图7所示;从血清、心和肝中鉴定的PM见表5、表6和图8。

注:圆角矩形结点的为器官或组织,椭圆形结点为靶点;蓝色结点为所有药物在所有组织或器官中没有实现回调;橙色边线的为下调,无色边线的为上调,紫色边线的为不同器官组织中调节方向不一样。图7 药效代谢差异物-器官/组织-药物相关关系网络

注:圆角矩形结点的为器官或组织,椭圆形结点为药效代谢差异物(PM);桃红色结点为三种药物共有的PM(除7不是变方1的),橙色结点为只是变方2的PM(除45也是鸡血藤的),绿色结点为变方2在部分器官或组织中的PM。深红色结点有银色边线的为鸡血藤与痹病药膳方变方1共有的PM,深红色节点有绿色边线的为鸡血藤与痹病药膳方变方2共有的PM。桃红色结点中,绿色边线的在心中不是PM,黄色边线的在肝中不是PM,紫色边线的只在血清中为PM,银色边线的为对应器官中的PM;橙色结点中,绿色边线的只在肝中为PM,紫色边线的在血清和肝中是PM,银色边线在对应器官中均为PM;绿色结点中,红色边线的在心中不是PM,桃红色边线的只在心中是PM,紫色边线的在血清中不是PM,银色边线的在肝中不是PM;深红色结点中,绿色边线的为鸡血藤与变方2共有的PM,银色边线的为鸡血藤与变方1共有的PM。图8 药效代谢差异物-器官/组织-药物相关关系网络

表4 VM名称及序号

表5 配方1和配方2在血清中PM结果

表6 配方3在不同组织器官中PM结果

从血清中鉴定出39个DM,分别鉴定出29、26和33个配方1、2和3的PM。 在血清中,当一半鸡血藤被同样质量的土茯苓代替时即为配方1变为配方2时,3个PM(VM 7、19、和45)消失;一些PM倍数变化(fold changes,FC)值如肌苷(VM 29,配方1组/模型组=16.39554381,配方2组/模型组=1.163027468)、三乙醇胺(30,配方1组/模型组=12.68455178,配方2组/模型组=7.942100461)和5-羟-β-吲哚乙醇(34,配方1组/模型组=1.677599136,配方2组/模型组=2.781925834)等存在明显差异,说明配方1和2的回调程度即药效程度明显不同。血清中,当配方2变成配方3时,2个PM(VM 23和40)消失,还识别出11个PM(VM 7、9、17、18、19、31、42、44 、45、47和48,同时发现PM(VM 12,2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇;VM 29,肌苷)FC值也发生改变。血清中,配方3有8个特有的PM;配方1和3有26个共同的PM,配方1和3有24个共同的PM,3个药物有24个共有的PM(图5、表5和表6)。这些结果表明方剂配方发生变化尤其是配方2变成配方3时,血清中发挥药效的代谢差异物发生了明显变化,表明代谢机制也发生了明显的变化。

从心和肝中分别鉴定出56和97个DM,33和41个配方3的PM。从血清、心和肝中都鉴定到6个 DM(VM 3、5、14、29、41和48);其中VM 29为血清、心和肝中共有的PM,VM 48只在心中为PM,VM 5为肝和血清中共有的PM,VM 41只为血清中的PM,VM 3和14为心和血清中共有DM。从心和肝中鉴定到16个有的DM(VM 49、54、56、57、59、63、65、66、74、75、78、79、83、89、91和95);VM 54、57、65和66只在肝中为PM,VM 49和91只在心中为PM,VM 74、75、78和79在心和肝中都是PM。从心和血清中鉴定到共有DM 10个(VM 1、7、9、15、18、27、31、32、35和47),VM 15、18和32只在血清中为PM,VM 47只在心中为PM,VM 1、7、9、27、31和35在心和血清中都是PM。从肝和血清中鉴定到共有DM 11个(VM 2、8、11、16、17、25、26、28、38、44和45),VM 16、26和44只在血清中为PM,VM 17只在肝中为PM,VM 2、11、25、38和45在肝和血清中都是PM。血清、心和肝中分别鉴定到18、31和71个特有的DM,其中分别有12、15和24个为PM。以上结果表明不同器官、组织中DM及其配方3在不同组织器官中PM存在巨大差异,即使是从不同组织或器官中都鉴定到的许多DM如VM 3、29、57和58等被调节的方向也不一致(见表6灰色背景),表明疾病的病理机制、药物在不同组织、器官中代谢机制存在巨大区别。

2.2.3代谢通路研究 应用MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路分析和通路富集分析阐明关键代谢通路(见表4、图6和图7)。结果表明血清中组氨酸(histidine)、糖鞘脂(glycosphingolipid)和精氨酸(arginine)代谢通路对3个配方都是极为重要的代谢通路;丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢(alanine,aspartate and glutamate metabolism),精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism),精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)以及组氨酸代谢(histidine metabolism)是配方3在心中发挥药效的重要代谢通路;精氨酸生物合成,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢(D-glutamine and D-glutamate metabolism),谷胱甘肽代谢(glutathione metabolism)以及丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢是配方3在肝中发挥药效的重要代谢通路。以上结果表明3个配方在血清中发挥药效所涉及的代谢通路差异不大,配方3在不同组织器官中代谢通路差异比较大。

图9 鸡血藤、痹病药膳方变方1和痹病药膳方变方2在血清中的代谢通路

图10 痹病药膳方变方2在心(左图)和肝(右图)中的代谢通路

3 讨论

LDL-C是导致AS的关键因素,降低其水平是降低AS发生和大多数心血管疾病死亡因素的重要途径;LDL-C与HDL-C的比值代表致动脉粥样化蛋白和保护性脂蛋白平衡关系,是用来预测心血管疾病发生的重要指标[19-21]。正常组、模型组、血脂康组、配方1组、配方2组和配方3组的LDL-C与HDL-C比值在30 d时分别为 0.61、1.44、1.03、1.57、1.24和1.00,60 d时分别是0.86、1.63、1.07、1.71、1.37和1.24;除配方1组外,这些结果基本与主动脉弓病理研究结果一致。这表明3个配方都能有效预防心血管疾病发生,配方3要优于配方2。

在3个配方血清代谢组学研究中,配方1和2的PM差异不大,配方3与二者的PM差异比较大。表明在配方3中,黄芪的量虽然小,但所起的药效却是非常重要的。此外,在优化痹病药膳方配方优化过程中一些PM消失,一些PM即使还在,但其FC值也发生了变化;表明当方剂的配方发生变化时其代谢轮廓也发生重要变化,合理组成让痹病药膳方产生了更多的选择性和专一性。

血液中代谢物的含量通常受多个蛋白支配,换而言之,当某个蛋白质表达出现异常时,其它组织或器官中的蛋白质会自动弥补其功能;因此,其它器官尤其是病理改变器官的代谢组学更值得进行研究。与血清代谢组学相比,从心和肝中鉴别了更多的PM,因此心和肝的病理形态差异以及蛋白质和基因表达差异值得深入研究。一些VM在不同组织器官中差异很大甚至方向相反,这与成分在体内代谢相关,因此其代谢规律值得深入研究。

本研究虽然通过不同配方对AS家兔预防药效来优化方剂配方,但配方有限。本研究虽然比较了3个配方在血清中PM和代谢通路差异,配方3在心和肝中PM和代谢通路差异,但这些药效代谢差异物之间哪些是关键的以及相互如何相互影响并不清楚。因此痹病药膳方配方优化和作用机制仍需深入研究。