On-line SPE HPLC-MS/MS 测定生物检材中的2-氯地西泮及其代谢物*

2024-01-12林贤文朱焕慧张海雁孙立敏

广东公安科技 2023年4期

林贤文朱焕慧张海雁孙立敏

（广州市刑事科学技术研究所，广东广州 510030）

从近年来案件检验情况来看，涉案药物以苯二氮卓类药物居多，涉新型苯二氮卓类化合物案件也时有发生，近期广州市辖区连续发生多起利用药物2-氯地西泮（diclazepam）进行违法犯罪的案件。2-氯地西泮是一种新型苯二氮卓类化合物，其结构式及代谢过程（见图1）。由于该类药物作用快、使用剂量少，受害者尿液、血液等生物检材提取不及时易造成漏检。目前，毒物分析检验方法所涉及的前处理和仪器分析大多是分开进行的，前处理方法主要有液液提取［1］、离线固相萃取［2］等，分析方法主要有气相色谱、气质联用、液相色谱、液质联用等。前处理是必不可少的关键步骤，但传统的前处理方法存在操作繁琐、步骤多、重现性差、抗污染能力差、耗时费力等问题。与传统的液液萃取、离线固相萃取前处理方法相比，近年来发展起来的在线固相萃取技术显著简化了样品前处理工作，具有自动化程度高、富集效果好、样品损耗量低、SPE 柱可重复使用等优点，在药物、毒物等分析检测领域得到越来越广泛的关注和应用。本文利用在线固相萃取-液质联用技术建立了生物检材中2-氯地西泮及其代谢物劳拉西泮、氯甲西泮、地洛西泮的分析检验方法，该方法简便快捷、灵敏度高，能够满足基层日常案件检验需求。

图1 2-氯地西泮结构式及其代谢过程

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

在线固相萃取模块、1290 超高效液相色谱仪、6470 三重四极杆串联质谱仪（安捷伦公司），离心机SIGMA 3-18K（SIGMA 公司）。

2- 氯地西泮、氯甲西泮（购自Sigma-Aldrich)，地洛西泮、劳拉西泮（购自北京迪朗生化科技有限公司），均为1mg/mL（甲醇）储备液；乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵（色谱纯，均购自Fisher 公司）；超纯水由Milli-Q 超纯水机（Millipore 公司）制取。

1.2 标准溶液的配制

其他系列标准工作溶液均从上述储备液用甲醇配制成所需浓度。

1.3 在线SPE 和液相色谱条件

在线SPE 柱：Agilent PLRP-S (15-20µm，2.1×12.5mm), Agilent 1260 在线SPE 四元泵，流动相：A 为5%甲醇水，B 为乙腈。分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 （3.0×150mm，2.7µm），Agilent 1290 二元分析泵，流动相：A 为5 mmol/L 醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸），B 为乙腈。柱温40°C，进样量20µL。六通阀切换、梯度上样及洗脱程序（见表1)，On-line SPE-LC-MS/MS 流路（见图2）。

图2 ON-LINE SPE-LC-MS/MS 流路示意图

1.4 质谱条件

电喷雾正离子模式（ESI+），多反应监测扫描模式（MRM）；毛细管电压3500V，喷嘴电压500V，鞘气温度350°C，鞘气流量11 L/min，干燥气300°C，干燥气流量5 L/min。4 种药物质谱参数（见表2）。

表2 4 种药物质谱参数

1.5 样品处理

取血液、尿液0.1 mL 置于15mL 离心管中，加入0.4 mL 乙腈沉淀蛋白，涡旋高速离心10 min，取上清液用纯水1：1 对等稀释，用0.45µm 滤膜过滤备检。

2 结果与讨论

2.1 在线SPE 条件优化

空白血按1.4 样品处理方法处理后全扫描分析，1.5 min 后基线回落走平，所以洗杂去除盐分、水溶性的蛋白等物质至少需要1.5 min，本方法六通阀上样切换时间选择3 min。

实验发现，4 种药物空白血液添加样品，在SPE 泵流速分别为0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min 情况上样分析，4 种药物的回收率差别不大，综合考虑后端色谱峰形、洗杂效果等因素，本方法SPE 上样流速选择1.0 mL/min。

分别考察100% 纯水、水（含0.1% 甲酸）、95%水（含0.1%甲酸）+5%乙腈、95%水+5%甲醇4 种SPE 上样流动相对萃取率的影响。实验结果表明，4 种物质在SPE 柱上保留效果较好，4 种流动相下各组分萃取率差别不大。考虑到样品洗杂效果、回收率等因素，上样SPE 流动相选择95%水+5%甲醇。

洗脱步骤完成后SPE 柱需要切换回SPE 流路，对SPE 柱再切换回SPE 流路时间进行考察，结果表明2-氯地西泮在SPE 柱上保留能力较强，至少需要20min 才能从SPE 柱上完全转移至分析柱上，此时SPE 柱及时切回SPE 回路，既可以保证待测组分回收率，又可以用高有机相冲洗杂质，活化SPE 柱，同时避免杂质等污染物进入分析柱及质谱中，根据实验结果，本方法SPE 柱从分析流路切换至SPE 流路时间点设置为20min。

2.2 色谱条件及在线SPE 条件的优化

从系统压力、分离效果、灵敏度等角度考虑，本方法选择5 mmol/L 醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸）、乙腈作为色谱分析流动相，由于目标物结构基团能够吸收电子，流动相中加入甲酸可以适当提高离子化效率。实验结果表明 4 种药物通过分析柱Poroshell 120 EC-C18 后，色谱峰出峰时间可以完全分离，结果如图3 所示。

图3 四种药物色谱图

2.3 质谱条件优化

使用单标溶液，选择ESI（+）电离模式，利用仪器自带Optimizer 自动优化软件分别对4种药物的母离子、子离子、Fragment 电压、碰撞能量等质谱参数进行确定优化，选择强度最高的两对离子作为定性分析离子，选择强度最强的离子作为定量离子，质谱主要参数（见表2）。

2.4 方法的工作曲线、检测限及回收率

在空白血液样品中添加2-氯地西泮工作液，得到2.5、5、50、250、500、1000 ng/mL 系列浓度的加标样品溶液，按上述1.5 方法对样品进行处理。以定量离子峰面积对目标物浓度进行线性回归，建立工作曲线y= 279101.543047x + 139.202842，相关系数R2=0.999 3，满足定量分析要求。按3 倍信噪比确定检出限为1 ng/mL，按10 倍信噪比确定定量限为2.5 ng/mL。