柚皮素通过自噬抑制乳腺癌细胞增殖的作用机制

叶志东 黄子圣 甘 玲 李佩霖 胡惠琼 胡亚楠 徐 莲，4 吴品信 赵 俐古维立

1 广州市第一人民医院普通外科（广东广州 510180）

2 广州消化疾病中心（广东广州 510180）

3 华南理工大学附属第二医院普通外科（广东广州 510180）

4 毕节市第二人民医院（贵州毕节 551700）

乳腺癌是当今女性最常见的恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第一位。柚皮素（naringenin，Nar）又称柚皮苷，主要来源于天然植物提取物，为常见的中草药中黄酮类化合物，存在于如柑橘类水果中［1］。柚皮素具有清除自由基、缓解动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性等作用。既往的研究显示，柚皮素在抗炎、清除自由基、抗氧化方面，对过敏性鼻炎、肝损伤、气道损伤及炎症反应等有效。既往的研究也提示柚皮素可在较高浓度下抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长，但具体的作用机制尚未明确。本文旨在明确柚皮素抑制乳腺癌增殖能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌细胞株MCF-7、人乳腺正常细胞系MCF-10A和小鼠乳腺癌细胞系4T1均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，柚皮素购于西安赛邦生物技术有限公司。Western Blot化学增强发光试剂盒（雅酶）。Anti-beta-actin购于Proteintech公司，Anti-LCI和Anti-Beclin1购于Abcam公司，Mouse Anti-Human，Rabbit Anti-Human购于CST公司。

1.2 方法

按照20、40、80 和120 μmol/L 4个浓度利用PBS制备柚皮素溶剂。通过CCK-8、平板克隆形成实验检测柚皮素对乳腺癌细胞的增殖作用，吸去培养皿细胞上清液，用PBS将细胞洗一遍后，加入适量胰酶将细胞消化下来，加入结晶紫染液染色15 min以上，吸去结晶紫染液，用清水轻轻洗净残余染色液，放于空气中自然干燥后，计数。应用流式细胞术检测柚皮素对乳腺癌细胞的凋亡作用，首先观察细胞是否处于对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数后，按4.0×105细胞的密度接种于6孔细胞培养板。本实验设的分组包括：对照组和柚皮素共2组；孵育 30 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。建立乳腺癌BALB/c小鼠移植瘤模型，对照组和柚皮素共2组，每组6只BALB/c小鼠。并以腹腔注射方式以柚皮素作用于模型小鼠，探讨柚皮素的体内抗肿瘤作用。按2.0×106细胞的密度接种于BALB/c 鼠皮下。待移植瘤直径达5 mm后随机分为对照组和柚皮素干预组共2组。对照组和柚皮素组每天分别腹腔注射PBS和终浓度为40 mg/kg的柚皮素PBS溶剂。待移植瘤直径超过15 mm时停止给药，麻醉后行颈椎脱臼处死小鼠，取移植瘤称重，并计算肿瘤体积，绘制生长曲线，肿瘤体积（V /mm3）=长×宽×宽/2。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测自噬相关基因，探讨柚皮素对乳腺癌细胞自噬的影响。本研究方案通过广州市第一人民医院伦理委员会审批（伦理批件号：K-2019-182-01）。

1.3 统计学方法

所有计量数据应用 SPSS 17.0 软件包进行统计学分析。细胞凋亡检测实验、克隆形成实验、鼠荷瘤实验中的计量数据采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 柚皮素对乳腺癌细胞（MCF-7、4T1）的抑制作用

通过细胞增殖实验检测了不同浓度不同时间柚皮素对乳腺癌细胞（MCF-7、4T1）和乳腺正常细胞（MCF-10A）的增殖抑制作用。结果发现，柚皮素对检测的2种乳腺癌细胞（MCF-7、4T1）均存在明显的增殖抑制作用，随着药物浓度的增加，增殖抑制作用增强，最佳的浓度为80～120 μmol/L。柚皮素对乳腺正常细胞系MCF-10A的增殖抑制不明显。故此，80 μmol/L浓度柚皮素为最佳作用浓度。见如图1。

图1 柚皮素对乳腺癌细胞和乳腺正常细胞增殖活力的影响（*P ＜0.001）

2.2 柚皮素可诱导乳腺癌细胞凋亡

经柚皮素处理后，MCF-7和4T1乳腺癌细胞株平板克隆能力下降（P＜0.001）见图2，可观察到80 μmol/L效果最佳。选取80 μmol/L为凋亡实验的观察浓度，经80 μmol/L柚皮素处理后，MCF-7和4T1乳腺癌细胞株出现明显的凋亡（P＜0.001）。见图3。

图2 柚皮素处理后，乳腺癌细胞平板克隆能力下降（***P ＜0.001）

图3 柚皮素处理后，乳腺癌细胞出现明显的凋亡（***P ＜0.001）

2.3 柚皮素对小鼠移植瘤具有明显的抑制作用，并可促进其坏死

使用4T1细胞在Bablc小鼠上构建了移植瘤模型，待肿瘤生长至5 mm×5 mm时，使用80 μmol/L的柚皮素处理。结果显示：柚皮素处理后，移植瘤生长速度明显慢于对照组，质量和肿瘤体积均小于对照组。病理HE染色结果提示：柚皮素处理组肿瘤组织出现明显的坏死（P＜0.001）。见图4。

图4 柚皮素可明显抑制4T1 乳腺癌细胞小鼠移植瘤的生长（**P ＜0.01，***P ＜0.001）

2.4 柚皮素诱导乳腺癌细胞自噬

自噬相关基因的表达检测结果中，经80 μmol/L柚皮素处理后，4T1乳腺癌细胞发生了明显的自噬。经80 μmol/L柚皮素处理后，4T1乳腺癌细胞自噬相关基因Beclin1、ATG5、HIF-1α、BAX和Bcl-2出现明显增加（P＜0.01），乳腺癌细胞发生了明显的自噬（见图5）。

图5 柚皮素处理后，乳腺癌细胞出现明显的自噬（**P ＜0.01，***P ＜0.001）

3 讨 论

柚皮素是存在于天然植物柑橘类水果中的类黄酮［1］，其已被证明可通过如诱导细胞凋亡、减少血管生成和调节氧化应激等多种机制来抑制乳腺癌的生长，但具体的作用机制尚未明确。植物化学物质因其安全性和成本效益而受到广泛关注。其中，来自柑橘属水果的柚皮素被认为是极具有潜力的抗癌新兴化合物。柚皮素是一种疏水性分子，分子量为272.25 Da，分子式为C15H12O5，它是柚皮苷水解的衍生物，主要以糖苷配基的形式存在，但也存在糖基化和新橙皮苷形式。作为一种无色无味的黄烷酮（一种类黄酮），柚皮素大量存在于柑橘类水果中，如葡萄柚和橙子。

在动物模型和人体研究中发现，柚皮素通过消化道吸收后，主要分布在胃肠道、肝脏、肾脏、肺和气管中。在柑橘类食物或者口服给药后，柚皮苷被口腔和小肠的肠道微生物群水解为柚皮素。柚皮素被吸收后通过Ⅰ期和Ⅱ期代谢反应代谢为葡糖苷酸和硫酸盐代谢物。代谢物和未吸收的类黄酮被微生物进一步代谢，产生酚类分解代谢物。该代谢物在动物和人类的尿液和粪便样本中均有检出［2］。

柚皮素因其具有与雌激素17β-雌二醇甾体核中的多酚环相似的结构而被称为植物雌激素，可以与雌激素受体，特别是雌激素受体-α结合，并与 17β-雌二醇竞争与雌激素受体的结合［3］。因此柚皮素对雌激素受体阳性或阴性乳腺癌细胞均具有抑制作用。另一项研究中，柚皮素作为部分激动剂（在完全激动剂如雌二醇或染料木素存在的情况下）在雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）中发挥竞争性拮抗作用［4］。柚皮素还能通过非雌激素依赖途径抑制细胞外调节蛋白激酶ERK1/2 磷酸化并改变雌激素受体α 定位。此外柚皮素还能有效调节循环中雌激素的代谢。研究发现，通过诱导慢性心理压力，会增加体循环雌二醇浓度并促进乳腺癌生长。在雌性小鼠模型中，柚皮素降低了心理应激诱导的雌二醇水平，从而限制了乳腺癌的生长和转移［5］。

氧化应激指细胞抗氧化防御机制不足以清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）或产生过量ROS的情况。因为氧化应激促进癌症的发生和发展，所以ROS是潜在的致癌物。乳腺癌细胞会产生高水平的ROS，导致基础氧化应激增加。然而越来越多的研究表明柚皮素对乳腺癌细胞氧化应激的调节有两面性。一方面，柚皮素作为众所周知的抗氧化剂可以保护细胞免受氧化应激，即中和ROS 的破坏作用［6］。另一方面，在高浓度下，类黄酮会表现出细胞毒性作用。类黄酮的细胞毒性有几种机制，包括抑制拓扑异构酶、激酶及其促氧化作用。ROS作为调节细胞死亡的关键信号分子其促氧化作用是这些化合物的选择性抗增殖活性的原因。已发现柚皮素具有促氧化潜力，通过诱导 ROS 生成导致癌细胞死亡［7］。

细胞凋亡是程序性细胞死亡，细胞凋亡机制受损会导致基因组受损的细胞存活下来，从而使其不受控制地增殖并引发癌变。 因此，能选择性抑制细胞增殖或阻断这种异常的死亡信号的化合物是治疗该癌症的候选药物。研究表明，柚皮素通过内在（线粒体）和外在途径诱导细胞凋亡。内在途径，柚皮素通过上调促凋亡基因如 P18、P21、p38、Bax和Bcl-2 的表达，刺激线粒体细胞色素c 释放，形成凋亡小体，从而增强半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶caspase-9 表达并导致细胞凋亡诱导。同时，柚皮素能够下调抗凋亡细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK 7 和 CDK 6的表达。通过调节癌症中细胞凋亡调节因子Bax/Bcl-2 比例，加强促凋亡蛋白的表达。研究表明，柚皮素与 CDK6 强烈结合，从而降低肺癌细胞（A549）和乳腺癌细胞（MCF-7）中形成集落的能力，控制肿瘤发生和进展［3-4］。外在途经，柚皮素可以通过激活肿瘤坏死因子（INF）相关的凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体DR5（TRAIL/DR5）途径诱导凋亡途径，从而导致caspase-8、caspase-3、caspase-9 增加聚ADP-核糖聚合酶PARP 的表达并增强细胞裂解，这提示细胞进入凋亡前阶段［8］。柚皮素另一种诱导细胞凋亡诱导的机制为调节乳腺癌细胞丝裂原活化蛋白激酶MAPK 家族成员（p38、ASK1、MAPK）和 p53的表达，它们在介导细胞凋亡中起重要作用。此外，柚皮素以剂量和时间依赖方式诱导三阴性人乳腺癌细胞（MDA-MR-231）DNA片段化和减少核因子-κB与 DNA 结合，从而将细胞周期停滞在G0/G1期和G2期，抑制乳腺癌细胞的生长［9］。

由于肿瘤的生长需要大量的营养，因此新血管生成是肿瘤发展所必需的。包括乳腺癌在内的许多实体瘤通过产生血管生成因子，主要是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）来诱导血管增殖。在体外模型中，柚皮素可抑制人乳腺癌细胞释放VEGF。在人内皮细胞模型中，柚皮素治疗抑制了体外血管生成，柚皮素还降低了内皮细胞中免疫球蛋白超家族细胞间黏附分子-1的表达以及单核细胞黏附，表明它在调节内皮功能方面具有潜在作用。柚皮素同时作为雌激素受体α的抑制剂，以 VEGF/激酶插入域受体通路依赖性方式阻碍血管生成和肿瘤细胞存活。研究还表明，柚皮素能有效抑制促血管生成的炎症细胞因子。此外，小鸡绒毛尿囊膜测定表明，柚皮素还可以抑制体内生理性血管生成［10］。许多研究已经证明柚皮素对乳腺癌的抗癌效果，因此它代表了一种极具潜力的癌症治疗生物活性化合物。

肿瘤细胞能够通过侵入过程侵入局部组织，并从它们的原始部位迁移到远处的部位，在那里它们通过转移过程形成新的肿瘤。研究发现，柚皮素可通过诱导程序性细胞死亡、caspase 刺激、G2/M 期细胞周期停滞和抑制来抑制人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）转移能力［11］。柚皮素还通过抑制蛋白激酶C磷酸化或减少转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）从跨高尔基体网络的运输，导致细胞内 TGF-β1 的积累，从而抑制乳腺癌的肺部迁移。在黑色素瘤和肺癌小鼠模型中观察到，柚皮素还可靶向TGFβ-Smad-MMP2通路抑制肿瘤侵袭转移［12］。

许多研究已经证明柚皮素对乳腺癌的抗癌效果，因此它代表了一种极具潜力的癌症治疗生物活性化合物。在这种背景下，由柚皮素和常用抗癌药物组成的联合疗法应运而生，作为一种新的治疗策略，柚皮素和常用抗癌药物的联合治疗显示出两者单一疗法所不具备的协同作用。各种研究已经证实，包括柚皮素在内的联合疗法在体外对不同类型乳腺癌具有很强的抗癌活性。使用他莫昔芬等药物靶向雌激素受体是一种常见的治疗方法，但长期使用会导致耐药性。与他莫昔芬联合使用时，柚皮素被发现比单独使用任何一种治疗更有效地抑制乳腺癌细胞（MCF-7）的活力。他莫昔芬和柚皮素的联合用药能够调节四种雌激素受体亚型，通过上调 ERβ 表达并下调 ER66、ER36和GPR30的基因转录诱导细胞凋亡。研究还发现，即使在没有雌激素的情况，柚皮素也能有效抑制乳腺癌细胞中激活的磷酸肌醇3-激酶和MAPK 增殖通路，从而阻断雌激素受体的激活抑制了乳腺癌细胞增殖，这与改善乳腺癌的不良预后有关［13］。此外，使用纳米胶束药物递送载体递送他莫昔芬和柚皮素可能是联合治疗乳腺癌的有效策略，因为该方法有效提高了药物摄取和缩小肿瘤大小。研究还发现，当固定环磷酰胺用量，乳腺癌细胞（MDA-MB-231）活力会以柚皮素剂量依赖性方式显著降低。与单独使用柚皮素治疗相比，联合治疗还着减少了乳腺癌数量并显著增加了凋亡蛋白Bax的表达。阿霉素类的化疗药物是乳腺癌化疗药物的基石，然而，阿霉素的长期使用会导致上皮-间质转换并通过片状伪足形成开始侵袭，这是转移过程的第一阶段。为降低阿霉素的不良影响，于是尝试柚皮素与阿霉素联合用药，结果显示联合用药治疗不仅增加了乳腺癌细胞（MDA-MB-231）毒性还抑制了这些细胞系的转移能力［14］。另一研究发现，与单用阿霉素相比，柚皮素联合二甲双胍和阿霉素在三阴性乳腺癌中无论在体内还是体外都具有更显著的细胞毒性作用。柚皮素与这两种化学治疗剂的联合治疗显著减少肿瘤体积，伴有细胞增殖减弱和明显的细胞坏死。这三种化合物的较小剂量可导致肿瘤坏死因子-α和白介素-1等细胞因子的产生更显著增加［15］。

本实验通过研究柚皮素对乳腺癌细胞的抑制作用，探讨柚皮素抑制乳腺癌细胞增殖的作用机制。柚皮素可明显抑制小鼠移植瘤体积增加，经柚皮素处理后，乳腺癌细胞自噬相关基因Beclin1、BAX、ATG5、HIF-1α和Bcl-2出现明显增加。通过应用柚皮素，乳腺癌细胞发生了明显的自噬，柚皮素能够通过多种机制刺激乳腺癌中来抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，延缓肿瘤的生长和转移。对于柚皮素可否应用于临床来治疗乳腺癌仍待进一步研究。